部分紅麻MYB轉錄因子基因序列的生物信息學分析

1、論文題目:部分紅麻MYB轉錄因子基因序列的生物信息學分析學院:生命科學學院專業(yè)年級:生物技術2011級學號:3115405030姓名:陳志超指導教師、職稱:徐建堂副研究員2015年5 月5 日Bioinformatics analysis on part of MYB transcription factor in Kenaf (Hibiscus cannabinus L.Submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in School of Life Sciences, FAFU

2、College:School of Life SciencesSpeciality:BiotechnologyEntrance year:2011I.D. No.: 3115405030Candidate: Chen ZhichaoSupervisor: Associate Prof. XU JiantangSubmitted: In May, 2015目錄摘要 (1英文摘要 (11引言 (11.1研究意義 (11.2前人研究進展 (21.3本研究切入點 (31.4擬解決關鍵性問題 (32材料與方法 (32.1 試驗材料 (32.2 總DNA提取 (42.3 目的基因的克隆與生物信息學分析 (

3、42.4 PCR擴增 (43結果與分析 (53.1紅麻DNA提取結果 (53.2紅麻MYB的PCR結果 (63.3 PCR產(chǎn)物測序結果(鉑尚測序公司 (73.4 DNAMAN比對結果 (73.5進化樹 (123.6 ORF分析 (134討論 (154.1 DNA提取與目的片段擴增 (154.2 關于目的片段引物設計 (154.3轉錄組測序結果驗證 (165結論 (16參考文獻 (16致謝 (18部分紅麻MYB轉錄因子基因序列的生物信息學分析陳志超福建農(nóng)林大學,生命科學學院,生物技術2011級摘要:通過對紅麻MYB相關轉錄因子進行序列驗證分析,為下一步開展MYB基因全長克隆奠定基礎。對紅麻MYB

4、轉錄組數(shù)據(jù)分析,從中篩選出92條與MYB相關序列,進行進化樹分析。從紅麻轉錄組中隨機挑選8條MYB基因,利用Oligo7 軟件設計特異引物,以紅麻品種福紅7號基因組總DNA 為模板進行中間片段擴增與擴增產(chǎn)物測序,利用DNAMAN8軟件及NCBI Blast進行序列比對分析。其中7條MYB 相關因子的基因序列相似度達99%以上,經(jīng)分析后均能獲得轉錄組序列的開放閱讀框。獲得基于轉錄測序的7條MYB轉錄因子相關序列中間片段,為下一步開展MYB基因全長克隆及功能驗證奠定良好基礎。關鍵詞:紅麻,MYB轉錄因子,轉錄組,基因克隆,比對分析Bioinformatics analysis on part of

5、 MYB transcription factor in Kenaf(Hibiscus cannabinus L.Chen zhichao, Fujian Agriculture and Forestry University, college of life science, Department of Biotechnology , Major of Biotechnology , Grade 2011, No.3115405030Abstract: Based on kenaf MYB related transcription factor sequence analysis, to

6、provide a basis for kenaf MYB gene cloning. Through the a nalysis of Kenaf transcriptome data, a total of 92 MYB transcription factor related sequence were selected from the data, and then analysis its phylogenetic tree.Eight kenaf MYB gene sequences were randomly selected from the data, using softw

7、are oligo7 to design specific primer s, with total genomic DNA of Varieties Fuhong No.7 as the template for the middle fragment, sequence alignment analysis using DNAMAN 8 software and NCBI Blast. Almond them there were seven sequences similarity were up to 99%, and both of them exist the transcript

8、ome sequence of the open reading frame. Obtained based on the transcription of sequencing seven MYB transcription factors related sequence fragment, the results could lay a good foundation for cloning and functional verification of MYB gene.Key words: Kenaf ;MYB Transcription factor; Gene cloning;Bl

9、ast1引言1.1研究意義20世紀以來,由于生態(tài)環(huán)境惡化,各國政府及科研機構都十分重視生態(tài)環(huán)境的修復和植物抗逆性育種的研究,而發(fā)掘和利用植物抗逆性有利基因,培育逆境條件下能保持相對穩(wěn)定的產(chǎn)量和品質的新品種,是抗逆性育種的重要目標1。紅麻(Hibiscus cannabinus L.是耐旱、耐鹽堿、適應性高、抗逆性強的韌皮纖維作物,廣泛開發(fā)利用于麻紡、板材、造紙、可降解地膜、生產(chǎn)動物飼料、食用和藥用等領域2。MYB 類轉錄因子是一類含MYB 結構域的轉錄因子,其命名源于禽成髓細胞瘤病毒致癌基因同源物類(v-myb avian myeloblastosis viral oncogenehomolo

10、g, MYB,其共有的特征具是有高度保守的MYB DNA 結合結構域。動物MYB 類轉錄因子的DNA 結合結構域通常含有3 個5053 個氨基酸的不完全重復區(qū),對應稱為之R1、R2 和R3 區(qū),每個MYB 區(qū)域中一般都含有3 個起著疏水核心的作用的保守的色氨酸殘基,可折疊成一個螺旋-轉角-螺旋的結構,是與目標DNA的大溝結合的結構基礎3。植物MYB 類轉錄因子可簡單地分成3 個亞類:R1-MYB、R2R3-MYB 和R1R2R3-MYB,其主要成員是含2個MYB 結構域的MYB 蛋白4,轉錄因子作為上游的調控因子可對下游相關功能基因的表達進行調控。前人研究表明:植物MYB 轉錄因子家族在植物生

11、長發(fā)育的全過程中發(fā)揮重要作用,其廣泛參與植物的次生代謝調控、木質素和纖維素的合成調控、對激素和逆境脅迫的應答5-7,并且在細胞分化、形態(tài)建成和光信號傳導等方面起到重要的調控作用8-11。但部分研究表明,并非所有的MYB 相關蛋白都是轉錄激活子,也有部分起負調控作用,抑制目標基因的表達4。利用轉錄因子對作物的抗逆性、抗病性進行改良比單純使用下游的某種功能基因改良作物抗逆性、抗病性,獲得的綜合效果更為理想12。目前尚未發(fā)現(xiàn)有關紅麻MYB研究的報道,本研究為紅麻MYB基因全長克隆及功能驗證奠定良好基礎,從而為改良紅麻品種,培育抗病、抗逆紅麻做好前期工作。1.2前人研究進展最早克隆得到的植物MYB 轉

12、錄因子是玉米的C1 基因13。隨著現(xiàn)代生物技術的迅猛發(fā)展,人們對轉錄調控研究的逐漸重視,獲得的各植物MYB 相關基因的數(shù)量也迅速增加,對其功能的研究也更加深入。目前已經(jīng)從各種植物中鑒定出了豐富的MYB 轉錄因子家族基因,如擬南芥中MYB 成員約有130個,玉米中約有100 個14, 15。Dai 等(2007將水稻OsMYB3R-2 基因在擬南芥(Arabidopsis thaliana中過量表達,發(fā)現(xiàn)轉基因擬南芥提高了對干旱、鹽、低溫和ABA 脅迫的耐受力16。甘蔗R2R3-MYB 類似基因Sc2RMyb1基因的表達受H2O2和NaCl 抑制而下調,推測該基因作為負調節(jié)因子參與了NaCl 脅

13、迫應答相關基因的調控過程11。從蘋果中分離鑒定的MdMYB1 能在擬南芥和離體培養(yǎng)的葡萄體細胞中異位表達合成花青素苷,并且發(fā)現(xiàn)MdMYB1 的啟動子區(qū)具有豐富的多態(tài)性17。2008 年,有研究發(fā)現(xiàn)文心蘭(Oncidium hybrid中的OgMYB1 和葡萄中的VlmybA1-3 轉錄因子都跟花器官或果皮著色有著緊密聯(lián)系18, 19。通過比較正常供水和干旱脅迫條件下葉片的差異蛋白質點,揭示出紅麻GA42 表現(xiàn)出較強的耐旱性與6 個差異表達蛋白質點的上調表達有關,分別為2 個Rubisco 或其大亞基、1 個推定的胞質型谷氨酰胺合成酶、1 個二甲基萘醌甲基轉移酶、1 個Rubisco 活化酶和1

14、 個ATP 合酶 亞基1。1.3本研究切入點蛋白質直接參與生物體內(nèi)生理生化反應,與性狀有直接聯(lián)系20,而蛋白質由基因表達,即基因直接或間接控制性狀,為進一步研究紅麻的抗病、抗逆基因從而改良紅麻品種,有必要在基因組水平上進行研究,對轉錄組序列進行驗證分析將為紅麻MYB基因全長克隆及功能驗證提供重要的參考價值。1.4擬解決關鍵性問題本研究應用生物信息學方法與技術,對紅麻MYB轉錄組序列進行驗證分析,驗證轉錄組序列的正確性,為進一步進行紅麻MYB基因全長克隆與功能驗證奠定良好基礎,從而為紅麻改良品種,選育優(yōu)良性狀紅麻做好前期工作。2材料與方法2.1 試驗材料以福建農(nóng)林大學作物遺傳改良實驗室篩選鑒定的

15、紅麻品種福紅7號為材料,播種于玻璃溫室大型陶瓷盆中,正常栽培管理,長出苗后每盆各留苗10 株,最后定苗為5 株。試驗于2014 年在福建農(nóng)林大學作物遺傳改良田間實驗室和福建農(nóng)林大學作物遺傳育種與綜合利用教育部重點實驗室進行。 圖1紅麻贊引1號 圖2紅麻福紅7號2.2 總DNA 提取本研究分別采用CTAB (4% 法21, 22以及Bioteke 試劑盒法提取紅麻葉片的基因組總DNA 。將提取的DNA 放置于20冰箱保存?zhèn)溆谩?.3 目的基因的克隆與生物信息學分析2.4 PCR 擴增反應體積為20L ,反應體系如下:2×Power Taq Master PCRmix 10LForwar

16、d Primer 1LReverse Primer 1LDNA 1LAdd ddH2O to a final volume of 20 µL引物對KFMYB-1R/ KFMYB-1F、KFMYB-2R/ KFMYB-2F和KFMYB-3R/ KFMYB-F、KFMYB-4R/ KFMYB-4F、KFMYB-5R/ KFMYB-5F、KFMYB-6R/ KFMYB-6F、KFMYB-7R/ KFMYB-7F、KFMYB-8R/ KFMYB-8F分別加入各自的PCR反應管中,反應在PCR儀(ABI 梯度PCR儀(型號Veriti上進行,熱循環(huán)條件為:stage1:預熱95 5 min;s

17、tage2:變性9545s,退火(5056 45 s,延伸721min,35個循環(huán);stage3:延伸7210min;4保存。取PCR產(chǎn)物5 µL,用1.2%的瓊脂糖電泳檢測,用凝膠成像儀(培清JS-2012自動對焦凝膠成像分析儀拍攝電泳圖片。(注:kenaf(紅麻簡寫為“KF”3結果與分析3.1紅麻DNA提取結果 圖3紅麻DNA凝膠電泳檢測通過比較分析,雖然傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA也可用于PCR擴增,但操作過程復雜、提取效率低。因此,本研究采用提取效果較好植物基因組DNA試劑盒進行DNA提取,從而提高實驗效率。結果如圖3紅麻DNA凝膠電泳檢測圖(試劑盒提取所示。3.2紅麻MYB的

18、PCR結果為得到最佳退火溫度,首先對每對引物設置50-56退火溫度梯度,通過1.2%瓊脂糖檢測,結果如圖4、5所示。從圖上可知,除第5對引物外,其他引物均能得到條帶整齊清晰的目的條帶,大小與預測片段大小基本一致,說明所設計的特異引物可用于紅麻MYB轉錄因子基因序列中間片段的擴增,為進行下一步實驗打下良好基礎。 圖4紅麻MYB引物1-4PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖4中:M為DL2000marker;16為紅麻MYB引物1,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56;712為紅麻MYB引物2,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56; 1318為紅麻MYB引物3,對應的退火溫度分

19、別為50,52,53,54,55,56;1924為紅麻MYB 引物4,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56。 圖5紅麻MYB引物5-8PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖5中:M為DL2000marker;16為紅麻MYB引物5,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56;712為紅麻MYB引物6,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56; 1318為紅麻MYB引物7,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56;1924為紅麻MYB 引物8,對應的退火溫度分別為50,52,53,54,55,56。3.3 PCR產(chǎn)物測序結果(鉑尚測序公司表1:紅麻PCR產(chǎn)

20、物測序結果訂單號生產(chǎn)編號樣品名稱樣品類型測序引物報告結果報告?zhèn)渥12034 F120490a hongma-KFMYB-1 PCR未純化KFMYB-1F_10P 成功F12034 F120490b hongma-KFMYB-1 PCR未純化KFMYB-1R_10P 成功F12034 F120491a hongma-KFMYB-2 PCR未純化KFMYB-2F_10P 成功F12034F120491b hongma-KFMYB-2PCR未純化KFMYB-2R_10P成功poly后雙峰F12034 F120492a hongma-KFMYB-3 PCR未純化KFMYB-3F_10P 成功F120

21、34 F120492b hongma-KFMYB-3 PCR未純化KFMYB-3R_10P 成功F12034 F120493a hongma-KFMYB-4 PCR未純化KFMYB-4F_10P 成功F12034 F120493b hongma-KFMYB-4 PCR未純化KFMYB-4R_10P 成功F12034 F120494a hongma-KFMYB-5 PCR未純化KFMYB-5F_10P 成功雙峰F12034 F120494b hongma-KFMYB-5 PCR未純化KFMYB-5R_10P 成功雙峰F12034 F120495a hongma-KFMYB-6 PCR未純化KFM

22、YB-6F_10P 成功F12034 F120495b hongma-KFMYB-6 PCR未純化KFMYB-6R_10P 成功F12034 F120496a hongma-KFMYB-7 PCR未純化KFMYB-7F_10P 成功后雙峰F12034 F120496b hongma-KFMYB-7 PCR未純化KFMYB-7R_10P 成功后雙峰F12034F120497a hongma-KFMYB-8PCR未純化KFMYB-8F_10P成功F12034F120497b hongma-KFMYB-8PCR未純化KFMYB-8R_10P成功表1為鉑尚測序公司對本研究提供的PCR產(chǎn)物的測序結果3.

23、4 DNAMAN比對結果將通過特異引物得到的PCR產(chǎn)物測序得到的堿基序列與轉錄組測序結果進行比對分析后可知,第1對和第4對引物測序結果與轉錄組測序結果完全一致。但其他幾對引物擴增所獲得的堿基序列存在單核苷酸突變、片段變異等情況。這可能是由于轉錄組測序時,所用的研究材料為贊引1號(來自非洲贊比亞,而本研究所用的材料為福紅7號(福建農(nóng)林大學選育,其品種之間基因組存在差異所致。比對結果如下: 圖6利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-1測序結果圖6為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-1A為紅麻MYB引物1轉錄組原序列,KF-1B為紅

24、麻MYB引物1的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到85%,相似度為100%,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。 圖7利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-2測序結果圖7為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-2A為紅麻MYB引物2轉錄組原序列,KF-2B為紅麻MYB引物2的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到62%,相似度為100%,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。 圖8 利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-3測序結果圖8為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序

25、結果序列進行比對的結果,其中:KF-3A為紅麻MYB引物3轉錄組原序列,KF-3B為紅麻MYB引物3的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到69%,相似度為99%,其中有6對堿基發(fā)生突變,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。 圖9利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-4測序結果圖9為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-4A為紅麻MYB引物4轉錄組原序列,KF-4B為紅麻MYB引物4的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到63%,相似度為100%,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。 圖10利用DNAM

26、AN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-5測序結果圖10為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-5A為紅麻MYB引物5轉錄組原序列,KF-5B為紅麻MYB引物5的PCR產(chǎn)物測序結果序列。比對不出結果,還有待于進一步研究。 圖11利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-6測序結果圖11為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-6A為紅麻MYB引物6轉錄組原序列,KF-6B為紅麻MYB引物6的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到72%,相似度為100%,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提

27、供重要參考依據(jù)。 圖12利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-7測序結果圖12為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-7A為紅麻MYB引物7轉錄組原序列,KF-7B為紅麻MYB引物7的PCR產(chǎn)物測序結果序列。其覆蓋率達到63%,相似度為99%,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。 圖13利用DNAMAN 8軟件比對紅麻MYB基因(KFMYB-8測序結果圖13為利用DNAMAN8對轉錄組原序列和PCR產(chǎn)物測序結果序列進行比對的結果,其中:KF-8A為紅麻MYB引物8轉錄組原序列,KF-8B為紅麻MYB引物8的PCR產(chǎn)

28、物測序結果序列。其覆蓋率達到65%,相似度為99%,其中由1對堿基發(fā)生突變,說明測序效果良好,為驗證轉錄組序列提供重要參考依據(jù)。3.5進化樹 圖14紅麻MYB轉錄因子進化分析(無自展值 圖15紅麻MYB轉錄因子進化分析(有自展值Kenaf進化樹分析方法:1.將提供的106條MYB序列進行結構域預測,篩選包含有兩個MYB-DNA-binding domain 的序列,e值小于-10的10條序列來做進化分析2.從plantTFDB數(shù)據(jù)庫中下載了大豆,水稻,玉米,擬南芥的MYB序列(這些序列都包含有兩個兩個MYB-DNA-binding domain3.將篩選到的10條序列與下載的大豆,水稻,玉米,

29、擬南芥的MYB序列進行多序列比對,使用mega6.0軟件,NJ(鄰近法構建進化樹(p-distence,bootstrap:10003.6 ORF分析表2 PCR產(chǎn)物測序序列ORF及其推導的氨基酸序列(*表示終止子 續(xù)表2 PCR產(chǎn)物測序序列ORF及其推導的氨基酸序列(*表示終止子 通過NCBI ORF Finder分析,8條PCR產(chǎn)物測序序列中的7條序列中均包含轉錄組測序序列的開放閱讀框,驗證了轉錄組序列的正確性。4討論4.1 DNA提取與目的片段擴增轉錄組測序使用的DNA為紅麻贊引1號的DNA,本研究的PCR使用的DNA為紅麻福紅7號的DNA,在對轉錄組序列與PCR產(chǎn)物測序序列進行比對時,

30、發(fā)現(xiàn)少數(shù)堿基變異,說明不同品種的紅麻之間存在微小差異。4.2 關于目的片段引物設計本研究所用的引物使用Oligo7軟件設計,引物長度為1827bp,GC含量為40%60%, Tm值為72左右,退火溫度為55左右,設計的8對引物通過PCR擴增的產(chǎn)物均能得到清晰的條帶,且其中7條能驗證轉錄組測序序列,由結果可知,這樣設計引物效果良好。4.3轉錄組測序結果驗證由PCR產(chǎn)物測序所得序列與轉錄組測序序列通過DNAMAN8比對及NCBI Blast比對,所測得的8條序列中有7條能驗證轉錄組測序序列,通過ORF分析,7條序列中均包含轉錄組測序序列的開放閱讀框,說明轉錄組序列的正確性,為下一步基因全長克隆及功

31、能驗證奠定良好基礎。5結論通過轉錄組測序獲得92條MYB轉錄因子相關序列,從中隨機選出8條進行序列驗證分析,其中7條相似度達99%以上,成功率達87.5%,均能獲得轉錄組測序序列的開放閱讀框,能夠正確驗證轉錄組測序的序列,為下一步開展MYB基因全長克隆與功能驗證奠定良好基礎。參考文獻1. 祁建民, 姜海青, 陳美霞, 徐建堂, 馬紅勃, 方平平, 林荔輝, 陶愛芬, 陳偉: 干旱脅迫下紅麻葉片的差異蛋白表達分析. 中國農(nóng)業(yè)科學2012(17:3632-3638.2. 方平平, 祁建民, 粟建光, 張廣慶, 林荔輝: 世界黃麻紅麻生產(chǎn)概況與發(fā)展前景. 中國麻業(yè)科學2009(03:215-219.

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