苦參堿對表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞P物質(zhì)受體和細胞因子表達的影響

1、苦參堿對表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞P物質(zhì)受體和細胞因子表達的影響劉繼勇，王玫，李鳳前，朱全剛，孫華君，胡晉紅基金項目：軍隊醫(yī)藥衛(wèi)生十五重點課題（01Z66），上海市科委基礎(chǔ)研究重點項目（No 05JC14046） *Corresponding author Tel:86-21-25070665, Fax: 86-21-25070668, E-mail: hujh （第二軍醫(yī)大學(xué) 長海醫(yī)院 藥學(xué)部，上海 200433） 摘 要： 研究苦參堿對表皮角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞和真皮成纖維細胞P物質(zhì)受體表達的影響，并探討苦參堿對P物質(zhì)誘導(dǎo)兩種細胞表達IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影響

2、。采用流式細胞術(shù)和Western blotting檢測分析苦參堿對兩種皮膚細胞P物質(zhì)受體表達的影響；以P物質(zhì)刺激HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，加入不同劑量的苦參堿共孵育，采用ELISA方法測定苦參堿對IFN-、IL-1、IL-6及IL-8分泌的影響。結(jié)果表明，苦參堿顯著抑制HaCaT細胞和真皮成纖維細胞P物質(zhì)受體的表達；P物質(zhì)刺激可以顯著增加HaCaT細胞和真皮成纖維細胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量；不同濃度的苦參堿均可以抑制皮膚細胞IL-1、IL-8的分泌，但對IFN-的分泌無明顯影響。P物質(zhì)和苦參堿對兩種皮膚細胞IL-6的產(chǎn)生均無顯著影響。關(guān)鍵詞： 苦參堿；P物質(zhì)受體；HaCaT

3、細胞；真皮成纖維細胞；細胞因子Effect of matrine on the expression of substance P receptor and cytokines production in human epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts.LIU Ji-Yong, WANG Mei, LI Feng-Qian, ZHU Quan-Gang, SUN Hua-Jun,HU Jin-Hong*(Department of Pharmacy，Changhai Hospital，Second Military Medical Un

4、iversity，Shanghai 200433，China)ABSTRACT To investigate the effect of matrine on the expression of neurokinin 1 receptor (NK-1R) and cytokines production induced by substance P (SP) in HaCaT cells (a human epidermal keratinocyte cell line) and dermal fibroblasts. The effect of Matrine on the expressi

5、on of NK-1R protein was detected by flow cytometry and Western blotting analysis.The modulation of Matrine on the production of interferon (IFN)-, interleukin (IL)-1, IL-6 and IL-8 in HaCaT cells and fibroblasts was measured by ELISA. The results showed that Matrine significantly inhibited the expre

6、ssion of NK-1R in HaCaT cells and fibroblasts. SP induced the production of IFN-, IL-1 and IL-8 in both cell types. Matrine 10-100g·mL-1 inhibited SP-induced IL-1 and IL-8 production in HaCaT cells and fibroblasts, while had no effect on the production of IFN- in both cells. Both SP and Matrine

7、 had no effect on the secretion of IL-6 in HaCaT cells and fibroblasts. These findings suggest that Matrine may be involved in the treatment of skin inflammation induced by SP by inhibition the expression of substance P receptor and regulation the production of IL-1 and IL-8 in epidermal keratinocyt

8、e and dermal fibroblasts.Key words: Matrine; substance P receptor; HaCaT cell line; fibroblast; cytokines; skin inflammation近年來，隨著“皮膚免疫系統(tǒng)”概念的建立和研究的不斷深入，皮膚的免疫功能日益受到研究人員的重視。皮膚免疫細胞主要包括樹突狀細胞（dendritic cells，DC）、朗格罕氏細胞（Langerhans cells，LC）、黑色素細胞（melanocytes，MC）、淋巴細胞及巨噬細胞等，這些細胞在皮膚免疫和皮膚炎癥中的作用已得到了深入研究1。但對于占

9、表皮組成約95的表皮角質(zhì)形成細胞（keratinocytes）和構(gòu)成真皮的主要細胞真皮成纖維細胞（fibroblasts）在皮膚免疫和皮膚疾病中的作用卻少有報道。P物質(zhì)作為一種速發(fā)型過敏反應(yīng)的炎癥介質(zhì)，已被證實參與了皮膚免疫和炎癥的調(diào)控過程，如促進細胞增殖，誘導(dǎo)細胞分化，調(diào)節(jié)細胞因子、粘附分子和趨化因子等活性介質(zhì)的釋放等。P物質(zhì)通過與高親和力的P物質(zhì)受體（neurokinin-1 receptor, NK-1R）結(jié)合或直接激活細胞內(nèi)的G-蛋白級聯(lián)反應(yīng)作用于皮膚細胞，從而調(diào)節(jié)皮膚免疫和炎癥反應(yīng)，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-皮膚免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用2,3。 苦參堿為豆科植物苦參Sophora flave

10、scens Ait.的主要成分，具有抗炎、抗過敏、抗心率失常及抗腫瘤等廣泛的生理活性。在治療皮膚疾病方面，苦參“苦可除熱，寒可涼血，燥可勝濕”，是外用治療銀屑病、皮膚瘙癢、蕁麻疹等炎癥性皮膚病最常用的中藥之一4。本研究采用由人腹部表皮衍化而成，具有與正常人表皮角質(zhì)形成細胞相似分化特征的HaCaT細胞株和經(jīng)原代培養(yǎng)的真皮成纖維細胞為工具，考察苦參堿對P物質(zhì)受體在這兩種細胞上表達的影響，并探討了P物質(zhì)和苦參堿對HaCaT細胞和真皮成纖維細胞分泌細胞因子IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的影響，為進一步闡明P物質(zhì)介導(dǎo)皮膚變態(tài)反應(yīng)的機制及苦參堿抗皮膚過敏的作用靶點提供依據(jù)。材料與方法 藥品與試劑

11、苦參堿（Matrine，Mat，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度98%）； Substance P （SP, Sigma公司）； 人角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基（K-SFM，Gibco/BRL公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco/BRL公司）；新生胎牛血清（FBS，杭州四季清生物制品公司）；胰蛋白酶（tissue culture grade，AMRESCO）；膠原酶（CLS-1,Worthington Biochemical Corp.）；分散酶（AMRESCO）；山羊多克隆P物質(zhì)受體抗體（美國Santa Cruz公司），工作濃度1200；HRP-兔抗山羊二抗（丹麥DAKO公司），工作濃度1100

12、；FITC兔抗山羊IgG（武漢博士德生物工程公司，Boster），工作濃度150；Human IFN- ELISA Kit（Bender Medsystems GmbH，Vienna，Austria）；Human IL-1、IL-6、IL-8 ELISA Kit 儀器 流式細胞儀 （美國Becton Dickinson公司）；垂直電泳系統(tǒng)（Mini-PROTEA）（美國Bio-Rad公司）；轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Mini Trans-Blot）（美國Bio-Rad公司）；UVPBioimaging Systems（美國UPLand公司）；MK2型酶標(biāo)儀（芬蘭 Labsystem公司）； Multiskan

13、 洗板機（芬蘭Labsystem公司）；Camera controller（日本Hamamatsu公司）；SDJ-ZS型生物潔凈工作臺（上海淀山湖凈化設(shè)備廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國FORMA公司）。細胞培養(yǎng) HaCaT細胞株由美國NIH米慶勝教授提供，培養(yǎng)基采用人角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基，置于5% CO2，37 飽和濕度孵箱中培養(yǎng)5。真皮成纖維細胞采用我室建立的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)6，培養(yǎng)基為含10%小牛血清的DMEM，置于5% CO2，37 飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，每2-3天換液傳代,取第6代以后的細胞進行試驗。流式細胞分析 取生長良好的HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，以1×108個

14、83;L-1密度接種于6孔培養(yǎng)板，分為空白對照組、SP（10-8 mol·L-1）刺激組、Mat（10-6 mol·L-1）組、NK-1R特異性拮抗劑Spantide I（10-5 mol·L-1）組及SP分別與Mat、Spantide共孵育組，每組設(shè)3復(fù)孔，作用時間均為24 h。待各處理組細胞增殖近融合后，按文獻方法處理7，加入NK-1R山羊多克隆抗體2.5 L及兔抗山羊IgG-FITC 3 L，室溫孵育、洗滌后以流式細胞儀檢測細胞表面平均熒光強度（average fluorescence intensity，AFI）。Western blotting分析 取H

15、aCaT細胞和真皮成纖維細胞，以2×108個·L-1密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，置于孵箱中培養(yǎng)。細胞生長近融合后，棄去上清液，以無血清DMEM為空白對照，分別加入含SP、Mat和Spantide的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)24 h。按文獻方法8進行蛋白抽提及SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，加入NK-1R山羊多克隆抗體（1100）2 L及HRP標(biāo)記的兔抗山羊二抗（15000）36+ L，室溫孵育、洗膜后以顯影液顯影，置UVP成像系統(tǒng)中攝影，定位。ELISA測定 以1×108個·L-1的密度將細胞接種于24孔培養(yǎng)板，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞平穩(wěn)生長7080

16、融合后，換以無血清DMEM培養(yǎng)基，靜息24 h。以無血清DMEM為空白對照，加入含SP和不同濃度Mat的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每組平行設(shè)3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸取上清液，1000 rpm離心5 min，-20保存。采用ELISA方法檢測上清液中IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的含量。統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行處理，組間比較采用Students t檢驗進行。結(jié) 果1 Mat抑制HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的表達流式細胞術(shù)檢測表明，NK-1R在HaCaT細胞和真皮成纖維細胞表面均有顯著的陽性表達。SP （10-8 mol·L

17、-1）可以使HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的平均表達量上調(diào)39.3%（P<0.01）和47.0%（P<0.01）。Mat（100 g·mL-1）或Spantide（10 mol·L-1）單獨作用于兩種皮膚細胞，對細胞上NK-1R的表達均無顯著影響。將Mat或Spantide與SP共孵育，均能抑制SP誘導(dǎo)的兩種皮膚細胞上NK-1R的表達。Mat可使HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上NK-1R的平均表達量分別下調(diào)33.0%（P<0.05）和44.5（P<0.01），Spantide 可使兩種細胞上NK-1R的平均表達量分別下調(diào)43.1%和46.

18、1%（P<0.01），（見圖1）。 Western blotting 分析表明，Mat可以顯著抑制NK-1R在HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上的蛋白表達，結(jié)果見圖2、圖3。*#Fig.1 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in HaCaT cells and fibroblasts. Cells were preincubated as follows for 24 h before detection. The average fluorescence intensity (AFI)

19、 was determined by flow cytometric analysis. 1.control; 2.matrine 100g/mL; 3.Spantide 10mol/L; 4.SP10nmol/L; 5.SP 10nmol/L+matrine 100g/mL; 6.SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L.Results are shown as mean ± SD values from three independent experiments. # P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs

20、. SP treated.（a） （b） 1 2 3 4 5 6Fig.2 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in HaCaT cells by Western blotting analysis. Cells were preincubated as follows for 24 h before detection. 1.control; 2.matrine 100g/mL; 3.Spantide 10mol/L; 4. SP 10nmol/L +matrine 100g/mL; 5.

21、SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L; 6.SP10nmol/L. (a) The protein expression of NK-1R in HaCaT cells.(b) -actin served as the internal control. （a）（b） 1 2 3 4 5 6Fig.3 Effect of matrine on the expression of neurokinin-1 receptor (NK-1R) in fibroblasts by Western blotting analysis. Cells were preincubated

22、as follows for 24 h before detection. 1.control; 2. SP 10nmol/L +matrine 100g/mL; 3. SP 10nmol/L+Spantide 10mol/L; 4. matrine 100g/mL; 5. Spantide 10mol/L; 6.SP10nmol/L. (a) The protein expression of NK-1R in fibroblasts.(b) -actin served as the internal control.2 Mat對HaCaT細胞分泌IFN-、 IL-1、IL-6及IL-8的影

23、響 HaCaT細胞自身可分泌少量IFN-、IL-1、IL-6及IL-8。以10nmol·L-1 SP刺激HaCaT細胞24 h后（10 g mL-1Con A共孵育），SP可以顯著增加HaCaT細胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量，分別由（27.3±4.8）ng·L-1、（22.2±1.4）ng·L-1、（34.1±3.9）ng·L-1升高到（75.4±2.2）ng·L-1、（37.0±5.6）ng·L-1和（46.9±9.1）ng·L-1。將不同濃度的Mat與

24、SP共孵育，10 g·mL-1和50 g·mL-1的Mat對IFN-的分泌無明顯影響，100 g·mL-1的Mat可增加IFN-的分泌量，但與對照組無顯著差異（P>0.05）。不同濃度的Mat均可以抑制SP誘導(dǎo)的IL-1和IL-8的分泌，其中100 g·mL-1的Mat可以使IL-1和IL-8的表達分別降低49.2%和58.4% （P<0.01）。但SP和Mat均對HaCaT細胞IL-6的分泌無顯著影響 （P>0.05）。結(jié)果見表1。Tab. 1 Effect of Matrine on the production of IFN-,

25、IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human HaCaT cells ( n=3,±s )GroupDose/ mol·L-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-127.3±4.875.4±2.235.5±4.584.0±4.372.9±9.696.

26、5±12.1-11.43.3-27.922.2±1.437.0±5.626.8±3.632.2±2.1*22.3±1.3*18.8±1.7*13.039.849.234.1±3.946.9±9.131.7±5.822.8±2.3*21.2±1.7*19.5±2.2*51.454.858.444.3±9.548.5±7.841.8±5.643.4±4.742.5±3.643.3±4.210.512.410.7

27、 P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs. SP treated （IR=Inhibition rate）3 Mat對真皮成纖維細胞分泌IFN-, IL-1、IL-6及IL-8的影響 真皮成纖維細胞分別與不同濃度的Mat共孵育，以10nmol·L-1 SP刺激24 h后（10 g mL-1Con A共孵育），用ELISA試劑盒測定細胞上清液中IFN-、IL-1、IL-6及IL-8的濃度。結(jié)果表明，SP可以顯著增加成纖維細胞IFN-、IL-1、IL-8的分泌量，分別由（54.5±5.1）ng·L-1、（22.

28、3±2.8）ng·L-1、（563.6±41.9）ng·L-1升高到（86.5±14.2）ng·L-1、（40.5±4.8）ng·L-1和（632.6±53.9）ng·L-1。與HaCaT細胞相似，10 g·mL-1和50 g·mL-1的Mat對IFN-的分泌無明顯影響，100 g·mL-1的Mat可增加IFN-的分泌量，但與對照組無顯著差異（P>0.05）。不同濃度的Mat均可以抑制SP誘導(dǎo)的IL-1和IL-8的產(chǎn)生，其中10-4 mol·L-1的

29、Mat可以使IL-1和IL-8的表達分別降低47.4%和39.0% （P<0.01）。但對IL-6的分泌無顯著影響（P>0.05）。結(jié)果見表2。Tab. 2 Effect of Matrine on the production of IFN-, IL-1, IL-6 and IL-8 in cultured human fibroblasts ( n=3,±s )GroupDose/mol·L-1IFN-IL-1IL-8IL-6C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng·L-1 /%C IR/ng

30、83;L-1 /%ControlSPMatSP+Mat-10-810-410g/mL-150g/mL-1100g/mL-154.5±5.186.4±14.262.5±7.284.9±10.488.2±2.4100.7±12.21.7-2.1-16.622.3±2.840.5±4.826.4±1.228.3±3.5*23.2±2.1*21.3±3.2*30.142.747.4563.6±41.9632.6±53.9582.0±51.1476.6&#

31、177;35.6*428.1±38.4*386.2±42.3*24.732.339.017.1±2.720.6±2.520.0±2.119.8±1.918.9±3.218.5±2.34.08.310.2 P<0.01 vs control. *P<0.05, * P<0.01 vs. SP treated.（IR=Inhibition rate）3 討論P物質(zhì)是最早發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)肽，廣泛分布于哺乳動物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)以及外周組織中，是除傳統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿、5-羥色胺、兒茶酚胺等以外的第3類神

32、經(jīng)活性物質(zhì)。P物質(zhì)通過與神經(jīng)激肽（neurokinin）受體結(jié)合發(fā)揮作用，其中與神經(jīng)激肽-1受體（NK-1R）的親和力最強。因此，NK-1R又特異性的稱為P物質(zhì)受體。P物質(zhì)參與皮膚疾病的免疫調(diào)控并非直接刺激免疫系統(tǒng)，而是通過與各類免疫細胞上的NK-1R結(jié)合，間接調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)9-10。在P物質(zhì)介導(dǎo)的許多皮膚炎癥中，NK-1R與其它炎性介質(zhì)之間存在正反饋調(diào)節(jié)機制，共同參與誘導(dǎo)皮膚細胞因子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，構(gòu)成協(xié)同放大效應(yīng)。我們前期的研究已經(jīng)證實11，在皮膚表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞上均存在有NK-1R的陽性表達，它參與介導(dǎo)了皮膚炎癥的病理過程。本研究探討了苦參堿對P物質(zhì)受體在表皮角質(zhì)形成細胞株HaC

33、aT細胞和真皮成纖維細胞上表達的影響。流式細胞術(shù)和Western blotting 分析均表明，苦參堿可以顯著抑制NK-1R在HaCaT細胞和真皮成纖維細胞上的表達。NK-1R可能是苦參堿抗皮膚過敏作用的一個新的靶點。細胞因子和趨化因子在多種皮膚疾病的病理過程中具有重要作用。P物質(zhì)可以調(diào)節(jié)巨噬細胞、單核細胞分泌TNF-、IL-1、IL-6、IFN-等12。在本研究中，我們考察了苦參堿對P物質(zhì)誘導(dǎo)的兩種皮膚細胞分泌IFN-、IL-1、IL-6和IL-8的影響。IFN-主要由Th1細胞產(chǎn)生，是重要的免疫調(diào)節(jié)因子。IFN-能增強Th1細胞的活性，增強細胞免疫功能；通過對Th2細胞的增殖的抑制作用抑制

34、體液免疫的反應(yīng)性。IFN-抑制Th2細胞產(chǎn)生IL-4，并抑制IL-4對B細胞的作用，特別是抑制B細胞生成IgE13。因此可見，IFN-對皮膚過敏性疾病的轉(zhuǎn)歸具有正性調(diào)節(jié)作用。本研究證實，HaCaT細胞和真皮成纖維細胞自身可以分泌IFN-，P物質(zhì)可以上調(diào)IFN-在這兩種細胞上的表達，高濃度的苦參堿可以使IFN-的分泌量增加，但與對照組無顯著差異。上述研究表明，苦參堿的抗皮膚過敏作用可能不是通過影響皮膚細胞IFN-的分泌而實現(xiàn)的。 IL-1是皮膚炎癥反應(yīng)中一種多效的細胞因子，它參與了皮膚免疫的調(diào)控過程。已有研究表明，離體的皮膚角質(zhì)形成細胞可以同時分泌IL-1 和 IL-114。我們的研究也證實，表

35、皮HaCaT細胞和真皮成纖維細胞均可以產(chǎn)生IL-1，P物質(zhì)促進了IL-1的產(chǎn)生，苦參堿對兩種細胞IL-1的表達均有顯著的抑制作用。抑制IL-1的產(chǎn)生是苦參堿抗皮膚過敏的一個新的作用環(huán)節(jié)。IL-8是趨化因子家族成員，參與了多種炎癥性皮膚病的發(fā)病過程。IL-8及其受體在表皮和真皮細胞中均有表達15。我們的研究發(fā)現(xiàn)，HaCaT細胞和真皮成纖維細胞IL-8的分泌差別很大，HaCaT細胞可以分泌少量的IL-8，而真皮成纖維細胞卻分泌大量的IL-8（>500pg/ml）?？鄥A可以顯著抑制P物質(zhì)誘導(dǎo)的兩種細胞IL-8的產(chǎn)生。本研究中，無論是P物質(zhì)還是苦參堿對IL-6的表達均無顯著影響，這可能與細胞種

36、類和刺激因素有關(guān)，IL-6在皮膚炎癥中的作用機理還有待進一步研究。參考文獻1 Ansel JC, Kaynard AH, Armstrong CA, et al. Skin-nervous system interactions J. J Invest Dermatol, 1996,106:198-204.2 Thomas A. Luger. Neuromediatorsa crucial component of the skin immune system J. J Dermatol Sci, 2002, 30:87-93. 3 Richard. L, OSullivan, Graeme

37、Lipper, et al. The neuro-immuno-cutaneous-endocrine network: Relationship of mind and skin J. Arch Dermatol, 1998, 134:1431-1435. 4 Xu CQ, Dong DL, Du ZM, Chen QW, Gong DM, Yang BF. Comparison of the anti-arrhythmic effects of matrine and berbamine with amiodarone and RP58866. Acta Pharmaceutica Sin

38、 2004; 39:691-4.5 Zhu QG, Hu JH, Fan GR et al. Metabolism of ketoprofen isopropyl ester in HaCaT cells J. Chin Pharm J（中國藥學(xué)雜志）,2003, 38: 22-25.6 Zhu QG , Hu JH, Fan GR, et al . Metabolism of ketoprofen isopropyl ester in skin cells J. Chin Hosp Pharm J（中國醫(yī)院藥學(xué)雜志）, 2002, 22 :195-197.7 Marriott I, Bost KL. Expression of authentic substance P receptors in murine and human dendritic cellsJ. J Neuroi