熒光定量PCR引物設(shè)計

1、熒光定量PCR引物設(shè)計專業(yè)的定量PCR設(shè)計軟件:beacon Designer有時一對100分的引物擴增效率特別低,換了一對貌似很爛的引物,結(jié)果溶解曲線卻長得很漂亮擴增效率也蠻高。個人認為這個跟你選擇的位置有關(guān)看引物Tm值相差是否很高,適當降低反應(yīng)退火溫度,看看是否有效看所擴增片段GC含量以及產(chǎn)物Tm是否很高,比方水稻基cDNA擴增常常用到GC buffer?？此脭U增基因是否為組織特異性表達看RNA是否完整是否降解,反轉(zhuǎn)錄過程是否完整設(shè)好內(nèi)參正對照最后,所有這些都滿足還是沒擴增出來,重新設(shè)計引物吧,(1設(shè)計的時候盡量靠近基因的3端,這樣能最大限度地保證擴增效率(2盡量跨越內(nèi)含子,這樣可以保證

2、檢測有無基因組污染(3兩條引物的Tm值不要相差太大(4產(chǎn)物長度保證在80200bp之間,最長300 bp。.如果想同時檢測很多對基因的變化,最好設(shè)計的時候記錄下產(chǎn)物的Tm值,這對你后面的實驗設(shè)計讀板溫度很有幫助。保證在產(chǎn)物Tm80以上(一般T m=80以下的峰都是引物二聚體,對于水稻等GC含量比較高的基因組,產(chǎn)物Tm不要高于94(個人觀點。如果同時檢測很多對基因的表達量變化,我會盡量調(diào)整所有產(chǎn)物的Tm值與內(nèi)參產(chǎn)物的Tm相差不太大,這樣方便實驗操作和最后的分析。(3相對錯配來說,我認為dimer和harpin對realtime PCR的影響更大(當然,也別錯配得太邪門了,非來一條跟產(chǎn)物出峰在相同

3、位置或者比產(chǎn)物峰還高的錯配就死了,引物的3端不要有錯配。(5一般我們用Primer Premier設(shè)計軟件,我一般先讓軟件自動搜索正義鏈或反義鏈的引物,找到一條評分是100的,再在它左右合適的位置手動搜索有沒有合適和它配對的評分也比較高的引物,一般5分鐘之內(nèi)可以搞定一個基因。實時定量PCR引物設(shè)計的具體要求1、引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)設(shè)計并具有特異性。最好位于編碼區(qū)5端的300-400bp區(qū)域內(nèi),可以用DNAMAN,Alignment軟件看看結(jié)果。2、不能形成2級結(jié)構(gòu)。3、引物長度一般在17-25bp之間,上下游引物不能相差太大。4、G+C含量在40-60%之間,45-55%最佳。5、堿基要隨機

4、分布,盡量均勻。6、引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。7、引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。8、引物5端可以修飾。9、3端不可修飾,而且要避開AT,GC rich的區(qū)域,避開T/C, A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)(2-3個。10、引物3端要避開密碼子的第三位。11、引物整體設(shè)計自由能分布5端大于3端。12、定量產(chǎn)物長度80-150bp最好,最長是300bp。 (1外參法+終產(chǎn)物分析。所謂“外參法”是指樣本與陽性參照在兩個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型沒有對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測,易出現(xiàn)假陰假陽結(jié)果,沒有監(jiān)測擴增效率,定量不準。(2內(nèi)參法+終產(chǎn)物分析。所謂“內(nèi)參法”是指樣本與陽性參照在一個反應(yīng)容器內(nèi)反應(yīng)。這種類型對樣本進

5、行質(zhì)控監(jiān)測,排除假陰結(jié)果,但是定量不準。(3外標法+過程監(jiān)測。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準,但是無法排除假陰結(jié)果。(4內(nèi)參法+過程監(jiān)測。由于樣本與陽性參照在一個容器內(nèi)反應(yīng),用同樣的Taq酶和反應(yīng)參與物,存在競爭性抑制,起始模板量濃度高的反應(yīng)會抑制起始模板量濃度低的反應(yīng),所以定量不準。(5外標法+過程監(jiān)測+內(nèi)對照。這種類型監(jiān)測擴增效率,陽性樣本定量準,同時排除假陰結(jié)果。這種類型是應(yīng)該提倡的。在國家沒有出臺陰陽判定標準時,所用PCR系統(tǒng)靈敏度最好達到一個拷貝(一個病毒。從理論上說,只要有一個拷貝數(shù),樣本就算陽性;一個拷貝數(shù)都沒有才算陰性。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR 擴增反應(yīng)中

6、每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR 反應(yīng)中,引入了一種熒光化學物質(zhì),隨著PCR 反應(yīng)的進行, PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線。PCR過程的監(jiān)測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式:(1R Green I 檢測模式。溫度循環(huán)為945572C三步法,只有引物,無探針,熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號,這種試劑檢測模式易產(chǎn)生非特異信號,且本底光較大。(2解探針模式(TaqmanHyd

7、rolysis Probe 。溫度循環(huán)為9460C 二步法,不僅有引物,還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個堿基上分別結(jié)合兩個熒光染料,一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài)。當Taq酶在60C延伸擴增鏈時,遇到探針,利用Taq酶53外切酶活性將探針水解成單個堿基,單個堿基之間距離較遠,第一個染料的能量無法傳給第二個染料,只好通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性,但是由于利用了Taq酶53外切酶活性,一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標,沒

8、有同時給Taq酶53外切酶活性定標,不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm僅要求其高于60C,這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊,而且無法做質(zhì)控檢測。(3雜交探針(Hybridization Probes模式。溫度循環(huán)為945572C 三步法,有引物,二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間,在一個探針3堿基上結(jié)合一個熒光染料,在另一個探針5堿基上結(jié)合第二個熒光染料。在55C時,兩個探針都剛好接合在模板上,第一個染料接受激發(fā)光得到的能量傳給了第二個染料,接受能量的第二個染料通過發(fā)射特征光子回到穩(wěn)定態(tài),通過對結(jié)合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑

9、檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關(guān),探針的濃度始終保持不變,因此可以在擴增后檢測熔解曲線作為信號的特異性質(zhì)控。另外這種試劑檢測模式可以用于點突變檢測。RT-q PCR是由三個步驟組成:1.反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA;2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;3.檢測:實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物.RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(Key porint:1.分析結(jié)果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測方法設(shè)計2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非標準化影響試驗的穩(wěn)定性3.數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀,如果不合理的分析,從分析結(jié)果中會得到混淆的錯誤結(jié)果,因此通過對RT-q PCR的每一組分進行質(zhì)量評價以達到最

10、小化變異性,最大化可重復性,而且還需要沿用一個通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對基因表達分析的標準化的需要是與人類臨床診斷分析相適應(yīng)的。存在的問題由于各個學術(shù)團體和科研機構(gòu)使用不同的操作流程,必然導致大家使用不同定量的來源物以及數(shù)據(jù)分析:1.新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品2.整個組織樣本,顯微切割樣本,單個細胞,組培細胞3.總RNA或者mRNA4.RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的不同的引發(fā)策略5.不同的酶以及酶的不同組合6.變異系數(shù)、靈敏度7.多類型的檢測化學方法,反應(yīng)的條件,熱循環(huán)儀的分析以及匯報方式。8.每一步驟缺乏標準化分析流程造成了在樣品的處理,內(nèi)參的使用,歸一化的方法,質(zhì)量控制等等因素嚴重影響RT-q P

11、CR的可信度,重復性。RNA 質(zhì)量評價現(xiàn)在RNA 定量的程序很多。最近EMBO q PCR courseRNA 質(zhì)量RNA 質(zhì)量主要包括RNA的純度(沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染以及完整性。傳統(tǒng)的RNA質(zhì)量的評價通過分析A260/A280的比值或者對瓊脂糖凝膠電泳rRNA 的條帶的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流體毛細電泳系統(tǒng)也是一種較新的分析方法。Agilent的2100也是一種十分好的分析RNA質(zhì)量的方法,它通過分析18S以及28S rRNA的分析圖譜,通過圖譜來反應(yīng)RNA的量和完整性,其完整性通過完整性系數(shù)(RIN來反應(yīng)。樣品的RINs在10

12、-4之間。10代表完整的RNA,4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100%準確定反應(yīng)mRNA的完整性,因為他們只是反應(yīng)rRNA的量來間接測定mRNA的完整性。這里推薦一種方法:采用GAPDH的3: 5分析法。我們使用oligo dT進行逆轉(zhuǎn)錄,然后對逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用multiplex熒光定量評價。設(shè)計三個taqman探針來定量三種相同大小的擴增產(chǎn)物。探針設(shè)計的位點分別位于3;5以及中部。擴增產(chǎn)物的之間的比值反應(yīng)RNA的完整性。如果3;5的比值在1,反應(yīng)較高度完整性,如果高于5說明降解。QRT-PCR抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴重減少了PCR的靈敏度以及熱動力學反應(yīng),高度的抑

13、制還導致假陰性的結(jié)果。抑制物的來源:生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物,鹽離子,尿素,血紅素,heparin以及IgG.是否有抑制物的評價體系:1.通過對目的樣品進行梯度稀釋進行PCR擴增效率的檢測2.通過內(nèi)部擴增對照來反應(yīng)樣品處理過程中樣本的情況3.用細菌檢測臨床樣品的抑制4.通過標準人工合成的擴增進行RT-PCR來反應(yīng)目標檢測物的抑制情況反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)1.RT和PCR單一酶系統(tǒng)2.RT和PCR分離的酶系統(tǒng)3.RNA逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇引物主要有三種:1.隨機引物:隨機引物,特別是6nt引物對所有的靶位點不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的結(jié)果,建議使用15nt的隨機引物.2.oligo-dT:只能用于mR

14、NA完整的樣品,特別有polyA .而且對于一些特殊的變異體以及較長的3UTR的區(qū)域比較困難3.特異引物:最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有:1.引物的濃度2.建議使用SYBR Green I和EvaGreen 進行擴增和溶解曲線的測試筆者建議的操作流程:一.靶的選擇和試驗設(shè)計1.針對目的基因序列選擇合適的擴增片斷查看以下三個網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實的QRT-PCR的擴增引物,探針以及反應(yīng)條件.B.DIY的軟件Primer Express引物設(shè)計簡介DNA引物長度:15-25 個堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合,可以考慮用LN

15、A替換幾個堿基,較少引物的長度以及避免引物次級結(jié)構(gòu)和3端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點之間的分之間的相互競爭,分之內(nèi)雜交,倒轉(zhuǎn)重復等等會引起引物的引發(fā)探針對結(jié)合效率降低,因此我們選擇引物二聚體的G為負值,即:10 kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.二、引物探針的保存一般遵循以下原則:1.正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10工作濃度.探針應(yīng)該避光保存,貯存在-70度,最好以凍干粉狀態(tài),工作濃度的液體保存一般兩周左右。3.檢查比對序列的多態(tài)性以及可能的錯誤避免這些區(qū)域來進行引物和探針設(shè)計4.靶序列中避免直接重復區(qū),在重復區(qū)進行雜交容易使得引物非獲得產(chǎn)物性結(jié)合,降低D

16、NA的擴增效率以及減少分析的靈敏度。5.考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶,通過分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界,主要通過cDNA和基因組序列比對來確定。一般都設(shè)計跨最長內(nèi)含子區(qū),這樣減少了擴增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的,特別當用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟的做法是讓下游引物跨越剪接接頭,這樣允許使用一條探針檢測可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無法保證情況下,可以使用跨越單一外顯子的設(shè)計方案。我們還是建議試驗者用DnaseI處理樣品,除去gDNA的污染。7.盡可能用60-150bp的擴增產(chǎn)物,GC含量在60%或者稍小來確定高效的變

17、性,更高度反應(yīng)效率。GC含量高度序列容易產(chǎn)生非特異性的反應(yīng),短序列擴增是的擴增時間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成,用來做擴增多標準曲線。用oligodT進行逆轉(zhuǎn)錄最好設(shè)計擴增子位于靠近模板的3區(qū)域.實時定量PCR體系的優(yōu)化1.基本參數(shù)的優(yōu)化:1MgCl2的濃度:在PCR反應(yīng)中,MgCl2的濃度對酶的活性是至關(guān)重要的,不僅如此,合適的MgCl2的濃度還能在反應(yīng)中得到較低的Cp(crossingpoint值(指PCR達到指數(shù)擴增期時,產(chǎn)生一定的熒光高于背景并為儀器所識別時的循環(huán)數(shù),較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的濃度選擇應(yīng)慎重。一般來說,對以DNA或cDNA為模板

18、的PCR反應(yīng),應(yīng)選擇2-5mM濃度的MgCl2,對以mRNA為模板的RT-PCR而言,則應(yīng)選擇的濃度為4-8mM。2模板的濃度:如果研究者是進行首次實驗,那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗,以選擇出最為合適的模板濃度,如果條件困難,也至少要選擇兩個稀釋度(高和中、低濃度來進行實驗。一般而言,使Cp位于15-30個循環(huán)比較合適,若大于30則應(yīng)使用較高的模板濃度,如果Cp小于15則應(yīng)選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定,經(jīng)驗上是SYBRGreenI探針的熒光信號比本底高2倍,雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。2.使用SYBRGreenI測定DNA時的條件優(yōu)化:1MgCl2的濃度:大多數(shù)引物

19、-模板對其的要求是2-4mM。2模板的濃度:初次實驗要求做一系列的稀釋濃度,如條件限制,至少完成兩個稀釋的度的測定。DNA在50ng-5pg之間選擇,質(zhì)粒DNA在106拷貝數(shù)左右。3引物的濃度:引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素,若濃度太低,會致使反應(yīng)不完全,若引物太多,則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng),0.3uM是個合適的濃度,若初次選用這個濃度不理想,可在0.1-1.0uM之間進行選擇,直至達到滿意的結(jié)果。4退火溫度:首次實驗設(shè)置的退火溫度應(yīng)比計算得出的Tm值小5,然后在1-2內(nèi)進行選擇。一般的,退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定,這個經(jīng)驗值往往會同計算得

20、到的Tm值有一定的差距。3.用SYBRGreenI進行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化:1MgCl2的濃度:不同的靶分子選用不同的濃度,通常是在4-8mM之間選擇。2模板的濃度:RT-PCR實驗既可以選用總RNA,又可以選用mRNA,其濃度應(yīng)在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度,可以增加適量的MS2或用alternativeRNA作為載體進行測定。3對照設(shè)置:每一引物都應(yīng)設(shè)有陰性對照,陽性對照和污染對照。QIAGEN的QuantiTect引物對QuantiTect Primer Assays引物設(shè)計,特別是SYBR Green方法做real-time RT-PCR的引物設(shè)計是比較考功夫的引物的

21、專一性是結(jié)果特異性的最重要保障,當需要選擇較小的片斷而非全長基因來做定量時,自行設(shè)計引物如何保證專一性和特異性有時不免令人頭疼。QuantiTect Primer Assays是Qiagen特別為SYBR Green方法做real-timeRT-PCR 而設(shè)計的引物對,涵蓋人類、大鼠、小鼠等7個物種基因組上13萬多個基因,這些已經(jīng)反復優(yōu)化、經(jīng)過預證的引物對能100%保證提供高度特異和靈敏的結(jié)果,最大的好處就是你可以節(jié)約很多時間,不必再為自行設(shè)計引物而頭疼,避免由于引物設(shè)計不當、或引物合成/純化問題而得不到理想的結(jié)果、以及避免由此而導致的精力、時間和實驗材料的浪費有的時候時間就是金錢,由于總是得不到理想的結(jié)果而不得不反反復復地重復實驗,這種苦頭大家或多或少都有體會吧?QuantiTect Primer Assays經(jīng)過Qiagen專家反復驗證,保證不會出現(xiàn)引物二聚體,能保證得到的結(jié)果在相當寬范圍內(nèi)的保持良好的線性關(guān)系,得到比探針法更靈敏的結(jié)果,那就不需要考慮更加昂貴的熒光探針法了,所以從某個角度來說,購買預證引物能省時省事,也能省錢的。用來快速做基因表達分析、基因沉默驗證或者是DNA芯片結(jié)果的驗證非常合適。當然,Qiagen預證引物對的合成質(zhì)量、純度你都