編碼表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體PEP

1、編碼表皮生長(zhǎng)因子受體型突變體PEP    作者：段小藝，王健生，郭佑民，劉敏，周斌，王全穎，楊廣笑    【關(guān)鍵詞】 基因克隆    摘要：目的 克隆出針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體型突變體(EGFRv)PEP3表位的cDNA片段，為高表達(dá)EGFRv腫瘤的免疫治療奠定基礎(chǔ)。方法 根據(jù)PEP3的堿基序列設(shè)計(jì)出有12對(duì)互補(bǔ)堿基的正負(fù)引物，正負(fù)引物互為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制備出兩端含酶切位點(diǎn)的PEP3 cDNA片段，再將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物亞克隆于載體pGEMT Easy構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEMT

2、Easy/PEP3。結(jié)果 經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測(cè)序證實(shí)，編碼PEP3的cDNA片段被成功擴(kuò)增并亞克隆于載體pGEMT Easy中。結(jié)論 成功克隆了編碼表皮生長(zhǎng)因子受體型突變體PEP3表位的cDNA片段。 關(guān)鍵詞：表皮生長(zhǎng)因子受體型突變體；PEP3表位；cDNA；基因克隆 ABSTRACT: Objective Through cloning the cDNA fragment encoding PEP3 epitope of epidermal growth factor receptor type mutant(EGFRv) to establish the base for im

3、munotherapy of carcinoma with high EGFRv expressing. Methods Designing the primer according to the base sequence of PEP3, cDNA was synthesized and amplificated by PCR. Then, the PCR product was subcloned into vector pGEMT Easy so as to construct recombinant plasmid pGEMT Easy/ PEP3. Results Zymocutt

4、ing restriction enzyme identification and DNA sequencing conformed that cDNA encoding PEP3 was amplified and subcoloned into pGEMT Easy successfully. Conclusion cDNA encoding PEP3 epitope of EGFRv was coloned successfully. KEY WORDS: epidermal growth factor receptor type mutant; PEP3 epitope; cDNA;

5、clone 表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)自分泌途徑是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，其介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。EGFR型突變體(EGFRv)是EGFR最常見的突變類型，在很多惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性變和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。EGFRv僅存在于惡性腫瘤組織，正常組織不表達(dá)，因此成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。近年來，EGFRv在惡性腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究中日益受到重視，特別是在腫瘤的生物治療中顯示出了巨大的臨床潛力。本研究通過PCR擴(kuò)增出編碼EGFRv突變區(qū)的13肽(PEP3

6、)的cDNA片段，并與載體pGEMT Easy相連接，構(gòu)建出pGEMT Easy/PEP3重組質(zhì)粒，為高表達(dá)EGFRv腫瘤免疫治療的研究奠定了基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 菌株、質(zhì)粒、工具酶及試劑 質(zhì)粒pGEMT Easy、大腸桿菌DH5均來自西安華廣生物工程公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq聚合酶均購(gòu)自華美生物公司和上海生工生物工程有限公司；主要試劑為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。 1.2 引物的設(shè)計(jì)和合成 通過GenBank查出EGFR和EGFRv基因全序列，根據(jù)EGFRv包含突變區(qū)13肽(PEP3，LeuGluGluLysLysGlyAsnTyrValValThrAspHis)氨基酸所對(duì)

7、應(yīng)的堿基序列，設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，正向引物：5CCTCGAGCTGGAGGAGAAGAAAGGTAATTAT GTG3，含有Xho酶切位點(diǎn)(CTCGAG)；負(fù)向引物：5CGGATCCGTGATCTGTCACCACATAATTACC3，含有BamH酶切位點(diǎn)(GGATCC)。正反向引物間有12對(duì)互補(bǔ)堿基，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)合成，HPLC純化。 1.3 目的基因的擴(kuò)增和純化 以正、負(fù)向引物互為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)過程如下：94預(yù)變性5min，40退火1min，72延伸70s，循環(huán)30次，72延伸5min。經(jīng)酚/氯仿抽提，無水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗滌沉淀后用10L TE充分

8、溶解沉淀。取1L PCR產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。 1.4 重組質(zhì)粒pGEMT Easy/PEP3的構(gòu)建與鑒定 取上述PCR產(chǎn)物400ng(0.2g /L)、質(zhì)粒pGEMT Easy 25ng(50ng/L)、T4DNA連接酶5U(5U/L)、10×T4DNA連接酶緩沖液1L以及去離子水5L(總體積10L)建立連接反應(yīng)體系，14連接16h。取50L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化0.1mL感受態(tài)大腸桿菌DH5，從LB平皿(Amp )中挑取單菌落用堿裂解法小提質(zhì)粒，經(jīng)BamH酶切，篩選出正確重組質(zhì)粒進(jìn)行大量制備。對(duì)含有目的基因片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司

9、)。    2 結(jié)    果 2.1 目的基因片段的擴(kuò)增與鑒定 根據(jù)GenBank中EGFRv cDNA序列設(shè)計(jì)出針對(duì)PEP3的兩條引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用10g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示在約50bp處可見一條擴(kuò)增條帶，此片段長(zhǎng)度與預(yù)期值相符(圖1)。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物（略） 2.2 重組質(zhì)粒pGEMT Easy/PEP3的鑒定 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的PEP3 cDNA片段與載體pGEMT easy連接產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用BamH酶切后質(zhì)粒被線性化，10g/L瓊脂糖凝膠電泳可見一約3050

10、bp的明顯條帶，證明PEP3 cDNA片段已經(jīng)重組于pGEMT Easy上(圖2)。 2.3 重組質(zhì)粒DNA序列分析 以pGEMT Easy通用引物對(duì)獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)定的結(jié)果表明插入的PEP3 cDNA片段與設(shè)計(jì)的XhoPEP3BamH片段序列完全一致，無堿基突變和讀碼框移位(圖3)。圖3 重組質(zhì)粒pGEMT Easy/PEP3 DNA測(cè)序結(jié)果（略） 3 討    論 許多惡性腫瘤均呈現(xiàn)EGFR過表達(dá)，以EGFR作為靶點(diǎn)的腫瘤治療已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展，但EGFR在人體許多正常組織亦有表達(dá)，使其應(yīng)用受到限制。EGFRvIII是EGF

11、R配體結(jié)合區(qū)缺失的突變體，它可在沒有配體結(jié)合的情況下組成性激活酪氨酸激酶，誘發(fā)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起細(xì)胞異常增殖并抑制凋亡。由于EGFRvIII僅高表達(dá)于惡性腫瘤組織，正常組織中檢測(cè)不到，因此以EGFRv作為靶點(diǎn)為高表達(dá)EGFRvIII腫瘤的特異性免疫治療提供了新的線索。Achim等發(fā)現(xiàn)，針對(duì)EGFRv的單克隆抗體MAb806能選擇性作用于表達(dá)EGFRv的腫瘤細(xì)胞，而對(duì)表達(dá)野生型EGFR的細(xì)胞不起作用。EGFRv特異性抗體在體內(nèi)能有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生CD 8 T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)，對(duì)抗體進(jìn)行適當(dāng)修飾(如連接毒素、脂質(zhì)體、病毒或放射性核素)可增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

12、腫瘤疫苗是一種很有發(fā)展前途的腫瘤免疫治療措施。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)EGFRv的疫苗以合成肽為主，其中對(duì)PEP3的研究最多。PEP3包含了EGFRvIII突變?nèi)诤蠀^(qū)，具有很強(qiáng)的特異性，它通過與MHC類分子結(jié)合，激活特異性T細(xì)胞，誘導(dǎo)CTL發(fā)揮主動(dòng)抗瘤效應(yīng)。為了克服短肽免疫原性弱，在體內(nèi)易降解的缺點(diǎn)，人們對(duì)PEP3進(jìn)行了各種免疫修飾或添加免疫佐劑，增強(qiáng)了其免疫原性和在體內(nèi)的穩(wěn)定性。    然而，人工合成肽對(duì)技術(shù)設(shè)備要求很高，費(fèi)用昂貴，難以普及使用。而通過基因工程技術(shù)使外源基因在大腸桿菌中表達(dá)目的基因具有表達(dá)量高、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、適合工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，并且可通過

13、基因工程技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行修飾和改進(jìn)。本研究根據(jù)已知的PEP3基因序列合成兩條3端部分堿基互補(bǔ)的長(zhǎng)鏈引物，再以兩條引物互為模板進(jìn)行延伸，使之成為完整的雙鏈DNA。這種方法相對(duì)傳統(tǒng)的PCR法操作更簡(jiǎn)單、費(fèi)用也低，并且可以保證延伸互補(bǔ)的準(zhǔn)確性。制備出的PCR產(chǎn)物通過T4連接酶與線性載體連接，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEMT Easy/EGFRv，鑒定和DNA測(cè)序與理論結(jié)果一致，為下一步構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒并進(jìn)行大腸桿菌原核表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn)： 1Moscatello DK, HolgadoMadruga M, Emlet DR, et al. Constitutive activation of phos

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