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1、第38卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究簡(jiǎn)報(bào)第2期2010年2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry249252DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00249表面活性劑增敏熒光光度法測(cè)定牛奶中的三聚氰胺黃暉李麗馬喬馮鈺锜何治柯3(武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢)摘要性劑(CTMAB)對(duì)三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用,在pH.2MAB為增敏劑,測(cè)定三聚氰胺,線性范圍為251000g/L,1.6%。按國(guó)標(biāo)方法處理樣品,采用本法測(cè)定,回收率偏高;,實(shí)際樣品檢測(cè)獲得滿意結(jié)果。此方法簡(jiǎn)便、快捷。關(guān)鍵詞;三聚氰胺;熒

2、光光度法;固相萃取整體柱1引言三聚氰胺(Melamine,M)對(duì)人和動(dòng)物造成的危害已引起廣泛關(guān)注。2008年10月我國(guó)發(fā)布的公告規(guī)定:嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;液態(tài)奶(包括原料乳)、奶粉、其它配方乳粉中三12聚氰胺的限量值為2.5mg/kg。目前,三聚氰胺的檢測(cè)方法主要有:液相色譜法(HPLC)、液相色3,456譜2質(zhì)譜法(HPLC2MS)、氣相色譜2質(zhì)譜法(GC2MS)和毛細(xì)管電泳等。針對(duì)這些方法,國(guó)家質(zhì)檢總局、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)發(fā)布的原料乳與乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)方法中,高效液相色譜7法的定量限為2mg/kg,液相色譜2質(zhì)譜/質(zhì)譜法的定量限為0.01mg/kg。

3、但上述檢測(cè)方法均需使用大810型儀器,且操作繁瑣。固相萃取整體柱與被分析物之間的選擇萃取作用已得到廣泛應(yīng)用。本研究利用三聚氰胺在弱堿性介質(zhì)中能產(chǎn)生熒光,表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)的增敏作用,22丙烯酰胺222甲基212丙磺酸2乙二醇二甲基丙烯酸酯聚合物(AMPS2co2EDMA)固相萃取整體柱對(duì)三聚氰胺良好的富集分離作用,采用整體柱對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理,實(shí)現(xiàn)了實(shí)際樣品的準(zhǔn)確檢測(cè)。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物,其分子中含有共軛雙鍵(鍵)結(jié)構(gòu),及3個(gè)給電子取代基NH2,其激發(fā)態(tài)由環(huán)外氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到環(huán)上而產(chǎn)生。由于它們n電子的電子云幾乎與芳環(huán)上軌道平行,因而實(shí)際

4、上它們共享了共軛電子結(jié)構(gòu),擴(kuò)大了其共軛雙鍵體系,故具有熒光特性,在非極性的介質(zhì)中,它的熒光較弱,隨著介質(zhì)極性的提高,其熒光強(qiáng)度也隨之增大,當(dāng)它處于酸性介質(zhì)中時(shí),取代基NH2會(huì)質(zhì)子化為NH3,熒光強(qiáng)度明顯減弱,甚至無(wú)熒光發(fā)生;而在弱堿性介+質(zhì)中,其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。據(jù)此建立了熒光分光光度法測(cè)定牛奶中三聚氰胺的方法。本方法適用于牛奶樣品中三聚氰胺的快速初篩及檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑RF25301pc熒光分光光度計(jì)(Shimadzu公司),LS55熒光分光光度計(jì)(PerkinElmer公司),PB210酸度計(jì)(Sartorius公司),TGL216G高速離心機(jī)(北京澤祥恒達(dá)科技發(fā)展公司),K

5、Q2200超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),S25渦旋儀(IKA公司),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE25299(鞏義市英峪高科儀器廠),TS2260雙重注射泵(保定蘭格恒流泵有限公司)。三聚氰胺,Tris(Sigma公司),Brij35(Acros公司),十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、十二烷基苯磺酸鈉(DDBS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、乙腈、正己烷,三氯乙酸,HCl和NaOH均為分析純?cè)噭?Tris2HCl緩沖體系(pH=8.0),水為Milli2Q超純水。2009206223收稿;2009208228接受本文系國(guó)家自然科學(xué)基金(Nos.90717111,20621502)資助項(xiàng)目3E2ma

6、il:zhkhe250分析化學(xué)第38卷2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制三聚氰胺(M)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制:精確稱取適量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品,配成質(zhì)量濃度為1.000g/L的儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制濃度為10mg/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。2.2.2熒光強(qiáng)度的測(cè)定在塑料離心管中依次加入2mLTris2HCl緩沖溶液、1.0mLCTMAB溶液、0.2mL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,加入超純水定容至4mL,室溫超聲10min,放置5min后,測(cè)定熒光強(qiáng)度。處理樣品。在離心管中分別準(zhǔn)確移取1mL牛奶樣品,加入5mLHCl酸化乙腈(pH=2.0),超聲10min,使蛋白質(zhì)沉淀,以r/min轉(zhuǎn)移合并上清液

7、,向上清液中多次加入20mL正己烷,振蕩,靜置,將下層清液2.2.3樣品制備方法1按國(guó)標(biāo)法7減壓蒸干,水溶,用微孔濾膜過(guò)濾得清液備用;方法2品。在離心管中分別準(zhǔn)確移取1mL,5(pH=3.0),渦旋1min,超聲10min,使蛋白質(zhì)沉淀,以8000r/m,用0.22m微孔濾膜過(guò)濾得待凈化液。(本實(shí)驗(yàn)室研制)中,用TS2260雙重注射泵,以100L/min,再用5%氨化甲醇洗脫,洗脫液于50下氬氣吹干,殘留物用水定容,1min,過(guò)0.22m微孔濾膜后,供測(cè)定用。73結(jié)果與討論3.1M2CTMAB體系的熒光光譜比較陽(yáng)離子表面活性劑CTMAB、陰離子表面活性劑DDBS、SDS、非離子表面活性劑Bri

8、j35等表面活性劑對(duì)三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用,發(fā)現(xiàn)表面活性劑CTMAB增敏效果較好。按2.2.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到M2CTMAB體系熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜(圖1)。由圖1可見(jiàn),在pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液中,M2CTMAB體系有2個(gè)激發(fā)峰,分別位于234和280nm,最大激發(fā)波長(zhǎng)為234nm。在此波長(zhǎng)激發(fā)下,三聚氰胺體系在345nm處有一個(gè)熒光峰(曲線3),以表面活性劑CTMAB增敏后,此處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(曲線2)。3.2緩沖體系酸度和緩沖溶液用量對(duì)M2CTMAB體系熒光強(qiáng)度的影響圖1M2CTMAB體系的激發(fā)光譜(1),發(fā)射光分別將pH4.58.5的磷酸鹽緩沖溶液、pH7

9、.0()MAB增敏時(shí)的發(fā)射光譜(3)1015的Tris2HCl緩沖溶液、HCl溶液(pH為0,1,2)和譜2和無(wú)CTFig.1FluorescentexcitationspectraofmelamineNaOH溶液(pH為12,13,14)2mL加入M2CTMAB體系中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在pH<6.5的酸性體系中,M2CTMAB體系melamineinbuffersolutionswithCTMAB(2)and無(wú)熒光;在NaOH堿性體系中,熒光強(qiáng)度較弱;在磷酸鹽緩withoutCTMAB(3)沖體系中,當(dāng)pH>7.0時(shí),在345nm處有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光峰;Tris2HCl緩沖體系中,當(dāng)p

10、H>7.5時(shí),在345nm處也有較強(qiáng)且穩(wěn)定的熒光峰,且熒光強(qiáng)度比磷酸鹽緩沖體系強(qiáng)(圖2)。同時(shí)比較了pH=8.0的硼酸2NaOH、硼砂2HCl、KH2PO42硼砂緩沖溶液體系,其熒光強(qiáng)度均低于Tris2HCl緩沖體系,故實(shí)驗(yàn)選擇pH=8.0的Tris2HCl緩沖體系。取不同體積的pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液,按2.2.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3。從圖3可知,當(dāng)緩沖溶液用量大于1.2mL時(shí),熒光強(qiáng)度最大且趨于穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)選擇pH=8.0的Tris2HCl緩沖溶液用量為2mL。3.3表面活性劑種類和用量及離子強(qiáng)度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響考察陽(yáng)離子表面活性劑CTMAB、陰離子表面活性劑DD

11、BS、SDS、非離子表面活性劑Brij35對(duì)三聚氰胺熒光強(qiáng)度的增敏作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),陰離子表面活性劑DDBS和SDS不能增強(qiáng)三聚氰胺熒光強(qiáng)度,陽(yáng)離子表面活性劑CTMAB和非離子表面活性劑Brij35均對(duì)三聚氰胺熒光有增敏作用,但CTMAB的增敏作用略強(qiáng),故選用CTMAB為增敏劑。改變CTMAB用量(0.10,0.25,0.50,0.75,1.0和1.25mL),按2.2.2的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)CTMAB用量在0.5mL以上,熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定(F190),故實(shí)驗(yàn)(M)2CTMAB(1),fluorescentemissionspectraof第2期黃暉等:表面活性劑增敏熒光光度法測(cè)定牛奶中的三聚

12、氰胺251圖2pH對(duì)M2CTMAB體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2EffectofpHonfluorescenceM2CTMAB23quantityofbuffersolutiononfluorescenceofM2CTMAB.0實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在相對(duì)誤差±5.00%范圍內(nèi),加入0.5mL2mol/LNaCl3.4M2CTMAB體系的超聲時(shí)間和體系的穩(wěn)定時(shí)間改變超聲時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在室溫條件下,超聲時(shí)間超過(guò)3min,體系的熒光強(qiáng)度已基本穩(wěn)定。為了使M2CTMAB體系更穩(wěn)定,選擇超聲時(shí)間為10min;在030min內(nèi)對(duì)已超聲10min的M2CT2MAB體系熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)M2CTM

13、AB體系熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。為實(shí)現(xiàn)快速測(cè)定三聚氰胺,本實(shí)驗(yàn)選擇超聲后放置5min測(cè)定。將體系放置2h后測(cè)定,體系熒光強(qiáng)度依然穩(wěn)定。3.5工作曲線和檢出限按優(yōu)化條件測(cè)定不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果如圖4。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:F=0.2552c(g/L)2+64.754,r=0.9995。式中F為熒光強(qiáng)度,C為溶液濃度,線性范圍為251000g/L。對(duì)空白溶液進(jìn)行9次測(cè)量,以其標(biāo)準(zhǔn)偏差3倍除以斜率得出該方法的檢出限19g/L。對(duì)500g/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液9次平行測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%。圖4不同含量M存在下體系的熒光光譜3.6共存物質(zhì)的干擾Fig.4EmissionspectraofM2CTMA

14、Binbuffersolutions當(dāng)三聚氰胺溶液濃度為500g/L,相對(duì)誤差±5.00%范圍內(nèi),考察發(fā)現(xiàn),牛奶中一些常見(jiàn)物質(zhì)對(duì)2+2+33+2+三聚氰胺測(cè)定的最大允許倍數(shù)分別是:Ca(300),Mg(300),K(4.16×10),Fe(25),Cu4(40),Zn2+(400),乳糖(1.43×10),維生素C(25)。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,上述共存物質(zhì)允許倍數(shù)均大于其在牛奶中的相對(duì)值,實(shí)際測(cè)定中不會(huì)對(duì)三聚氰胺的測(cè)定造成干擾。3.7樣品分析withdifferentconcentrationsofM采用兩種方法分別對(duì)奶樣進(jìn)行前處理,并進(jìn)行測(cè)定,均未檢出三聚氰胺。對(duì)

15、樣品進(jìn)行各個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收率測(cè)定,結(jié)果如表1所示。對(duì)兩種樣品預(yù)處理的方法進(jìn)行比較,可以看出,方法1中,樣品的表1樣品加標(biāo)回收率Table1Recoveriesofspikedsample序號(hào)No.123加入量Added(g/L)25125250方法1Method1測(cè)量值回收率Found(g/L,n=6)27.6131.8262.4Recovery(%,n=6)110.3105.4105.0RSD(%)3.2.2.823序號(hào)No.123加入量Added(g/L)25125250方法2Method2測(cè)量值回收率Found(g/L,n=6)23.7121.8250.5Recovery(%,n=6

16、)94.797.4100.2RSD(%)6.4.3.574252分析化學(xué)第38卷加標(biāo)回收率均高于實(shí)測(cè)值,易導(dǎo)致實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中出現(xiàn)假陽(yáng)性,造成較大誤差;方法2使用固相萃取整體柱進(jìn)行預(yù)處理,樣品的平均回收率接近實(shí)際加入量,避免假陽(yáng)性的產(chǎn)生,提高了方法的可行性。本方法樣品前處理簡(jiǎn)單,分析時(shí)間短,不需使用大型儀器,且經(jīng)濟(jì)環(huán)保。可用于大量牛奶樣品中三聚氰胺的快速初篩及檢測(cè)。References1BulletinNo.25ofMinistryofHealthofP.R.China,MinistryofIndustryandInformationofP.R.China,MinistryofAgricul

17、tureofP.R.China,StateAdministrationforI&ministra2tionofQualitySupervision,InspectionandQuarantineofP.BLimitationofMelamineinMilkandtheDairyProducts)衛(wèi)生部、2008年第25號(hào)(關(guān)于乳與乳制品)p:2Muiz2os2SG,Rosales2martinezD,Gonzalo2LumbrerasR,Santos2MontesA,Cubedo2Fernandez2TrapiellaA,IRC.Anal.Bioanal.Chem.,2008,392(

18、3):5235313AndersenWC,TurnipseedSB,KarbiwnykCM,ClarkSB,MadsonMR,GiesekerCM,MillerRA,RummeNGL,ReimschuesselR.J.Agric.FoodChem.,2008,56(12):434043474LIAi2Jun(李愛(ài)軍),ZHANGDai2Hui(張代輝),MAShu2Min(馬書民),LIMing(李明),ZHANGXiu2Zhen(張秀珍),YAOTian2Ling(姚天靈).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2008,36(5):6997015WUHui2Qin(吳惠勤),

19、HUANGFang(黃芳),LINXiao2Shan(林曉珊),DENGXin(鄧欣),MAYe2Fen(馬葉芬),HUANGXiao2Lan(黃曉蘭),ZHUZhi2Xin(朱志鑫),LUOHui2Tai(羅輝泰).ChineseJ.InstrumentalAnalysis(分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2008,27(10):104410486RAOQin2Xiong(饒欽雄),TONGJing(童敬),GUOPing(郭平),LIHai2Yan(李海燕),LIXiao2Wei(李曉薇),DINGShuang2Yang(丁雙陽(yáng)).ChineseJ.Anal.Chem.(分析化學(xué)),2009,37(9):

20、134113447GB/T2238822008.DeteminationofMelamineinRawMilkandDairyProducts(原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法).NationalstandardsofP.R.China(中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))8ZhengMM,ZhangMY,FengYQ.J.Sep.Sci.,2009,32(11):196519749YINHong2Rui(尹宏瑞),MAQiao(馬喬),FENGYu2Qi(馮鈺锜).J.Anal.Sci.(分析科學(xué)學(xué)報(bào)),2009,25(1):172010HUANGJing2Fang(黃京芳),FENGYu2Qi(馮鈺锜

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