聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物介導(dǎo)體外基因傳遞 醫(yī)學(xué)論文

1、    聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物介導(dǎo)體外基因傳遞 醫(yī)學(xué)論文               【摘要】   【目的】 研究 非病毒基因載體聚乙二醇(PEG)-聚乙烯亞胺(PEI)共聚物的組成對(duì)體外介導(dǎo)基因傳遞的 影響 ?！?方法 】 將含PEG不同分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物，與DNA形成復(fù)合物。考察帶正電荷的PEI與帶負(fù)電荷的DNA的相互作用，測(cè)定了PEG-PEI/DNA復(fù)合物的粒徑和Zeta電位，及對(duì)Hela細(xì)胞的毒性

2、和轉(zhuǎn)染率。【結(jié)果】 PEG側(cè)鏈并未明顯影響PEI與DNA形成復(fù)合物的能力；連接PEG 5 000 能夠明顯降低復(fù)合物的粒徑；復(fù)合物的Zeta電位隨著PEG接枝量的增加而降低；細(xì)胞毒性不依賴于PEG的分子量的變化，而是取決于PEG的接枝量；共聚物PEG-PEI(2-25-1)被證實(shí)為較有效的介導(dǎo)體外基因傳遞的復(fù)合物。【結(jié)論】 共聚物的結(jié)構(gòu)組成對(duì)DNA復(fù)合物的理化性質(zhì)、毒性和轉(zhuǎn)染率都產(chǎn)生較大的影響。 本文由中國(guó)論文范文收集整理。【關(guān)鍵詞】   PEG-PEI共聚物； 非病毒基因載體； 基因轉(zhuǎn)染  基因 治療 是將外源性基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)有效表達(dá)，從而使得在基因水平治療一些頑疾成為

3、可能。將外源性基因?qū)塍w內(nèi)必須借助于一個(gè)安全、穩(wěn)定、轉(zhuǎn)染率高的載體。 目前 ，基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體。體內(nèi)基因治療80%采用病毒載體系統(tǒng)作為基因傳輸載體, 例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等,非病毒載體包括脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物。病毒載體與非病毒載體相比轉(zhuǎn)染率高，但存在著一些安全隱患，如對(duì)特異的細(xì)胞有限制性靶向性，DNA裝載量有限，潛在的病毒重組和成本較高等 問(wèn)題 使得它的實(shí)際 應(yīng)用 受到限制。非病毒載體如陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子共聚物可克服目前病毒載體在安全性、免疫原性和價(jià)格方面等問(wèn)題。在目前應(yīng)用的非病毒載體中，多聚陽(yáng)離子共聚物聚乙烯亞胺（polyethylenimine, PEI

4、），在體內(nèi)外都表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)染率。  PEI的重復(fù)結(jié)構(gòu)單體中每?jī)蓚€(gè)碳原子就連接含氮原子的伯胺和仲胺，支鏈型的PEI還包括叔胺，都可質(zhì)子化生成正電性氨基，成為與DNA上帶負(fù)電荷的磷酸根結(jié)合的作用點(diǎn)，形成納米級(jí)的聚合物/DNA復(fù)合物，可被細(xì)胞攝取。另一方面，大量的陽(yáng)離子電荷產(chǎn)生較大的毒性，限制了陽(yáng)離子共聚物的體內(nèi)應(yīng)用。因此，許多學(xué)者研究將陽(yáng)離子共聚物連接上非離子的親水性基團(tuán)，如聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）， 聚 。這些親水性的共聚物可提高復(fù)合物的溶解性，減少聚集，減少生理環(huán)境下與蛋白的非特異性相互作用 。本文采用異佛爾酮二異氰酸酯（isoporon diis

5、ocyanate, IPDI）作為偶聯(lián)劑制備了含不同PEG分子量和接枝量的PEG-PEI共聚物?？疾炝司酆衔?DNA復(fù)合物的粒徑和zeta電位，還考察了轉(zhuǎn)染率與PEG-PEI共聚物的毒性和結(jié)構(gòu)的關(guān)系。研究PEG鏈長(zhǎng)與接枝量對(duì)基因傳遞過(guò)程的影響和 規(guī)律 。    1   材料和方法     1.1   試劑     聚乙烯亞胺（PEI，MW25000， Aldrich-Sigma公司產(chǎn)品，支鏈型，無(wú)水）；聚乙二醇單甲醚(mPEG, MW 為2000和5000

6、 ，F(xiàn)luka公司)； IPDI(廣州市匯采涂料化學(xué)品有限公司，進(jìn)口分裝）；二月桂酸二丁基錫（dibutyltin dilaurate, DBTL，廣東麗寶涂料助劑公司）。    1.2   細(xì)胞系    人宮頸癌細(xì)胞系 Hela細(xì)胞（ATCC No.CCL-2.1），在100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。血清56 滅活30 min。    1.3   質(zhì)粒    真核表達(dá)質(zhì)粒編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced

7、 green fluorescent protein, pEGFP-C1)，由華西醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)，由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，在DH5菌株中大量擴(kuò)增。由QIAGEN公司的質(zhì)粒大抽提試劑及純化柱制備質(zhì)粒，酶切鑒定。    1.4   異氰酸酯單端基聚乙二醇（PEG-NCO）的制備      定量的mPEG溶于無(wú)水氯仿中，加入過(guò)量的IPDI，溶于氯仿，再加入0.6%0.7%的催化劑DBTL。將上述兩溶液混合， 75 左右回流反應(yīng)8 h，所得產(chǎn)物在石油醚中沉淀，沉淀用氯仿溶解，再用石油醚沉淀，此操作重復(fù)多次直至

8、將過(guò)量的IPDI去除干凈，真空干燥，得白色蠟狀至粉末狀固體。    1.5   PEG-PEI嵌段共聚物的合成      將PEI用一定量的氯仿溶解，磁力攪拌下將PEG-NCO的氯仿溶液逐滴加入PEI溶液中，再加入0.6%0.7%的催化劑DBTL，置60 回流反應(yīng)16 h，將亮黃色溶液濃縮至約50 mL左右，再用大量乙醚沉淀，過(guò)濾，真空干燥，稱質(zhì)量。    1.6   PEG-PEI/DNA復(fù)合物的制備   

9、0; 根據(jù)不同的N/P比，即聚合物中的氨基基團(tuán)與DNA中的磷酸基團(tuán)的摩爾比，用PBS制備一定的聚合物溶液，與質(zhì)粒DNA的PBS溶液混合，渦旋，室溫靜置30 min,以獲得聚合物/DNA復(fù)合物。    1.7   細(xì)胞毒性測(cè)定（MTT法）    PEI、PEG-PEI共聚物在100 mL/L胎牛血清的1640培養(yǎng)基中配成不同濃度梯度，分別為1、3、5、10、15、20 g/mL。將Hela細(xì)胞接種到96孔板上，密度為5 000個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。吸去每孔中的舊培養(yǎng)液，加入不同濃度的含PEI及PEG-PEI共聚物的培養(yǎng)液，每孔0.2 mL，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，37 ，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換正常的 RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液150 L ，在Bio-Tek Elx800型酶標(biāo)儀490/630 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（A）， 計(jì)算 細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組A490/630/陰性對(duì)照組A490/630×100%。 關(guān)鍵詞:傳遞,基因,病毒,載體,復(fù)合,PEI,醫(yī)學(xué)論文,聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物介導(dǎo)體外基因傳遞 內(nèi)容摘要:【摘要】 【目的】 研