稀土熒光探針檢測(cè)多巴胺及類(lèi)似物.

1、稀土熒光探針檢測(cè)稀土熒光探針檢測(cè)多巴胺及類(lèi)似物多巴胺及類(lèi)似物答辯人：袁潔導(dǎo)師：趙美萍 副教授2003年6月18日n選題背景n已有檢測(cè)方法綜述n實(shí)驗(yàn)部分n總結(jié)n致謝兒茶酚胺的結(jié)構(gòu) 及生理意義n兒茶酚胺（catecholamine, CA）的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和生理意義n神經(jīng)遞質(zhì)在單細(xì)胞檢測(cè)中的意義Dopamine（DA）n瑞典神經(jīng)藥理學(xué)家Carlsson于1958年首次提出腦內(nèi)多巴胺(DA)是獨(dú)立的神經(jīng)遞質(zhì) n正常值范圍為血漿：888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。n增高會(huì)引起嗜鉻細(xì)胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮癥酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低會(huì)引起植物神經(jīng)病變，帕金森病等。 Epi

2、nephrine（E）& nor epinephrine （NE） 在人體內(nèi)的正常值 范圍為 血漿：480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24hl在人體內(nèi)的正常值范圍為血漿：615-3240pmol/L； 尿：0-590 nmol/24h對(duì)兒茶酚胺的檢測(cè)手段對(duì)兒茶酚胺的檢測(cè)手段檢測(cè)方法靈敏度優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)放射酶學(xué)法放射酶學(xué)法2.210 -1 0 M ,靈敏度高 ，選擇性好技術(shù)難度高 ，檢測(cè)速度慢，危險(xiǎn) HPLC法法 depends分離效果好 ，可結(jié)合不同檢測(cè)器應(yīng)用流動(dòng)相有可能影響檢測(cè)效果熒光測(cè)定法熒光測(cè)定法(THI(THI、EDA) EDA) 10 10M-10 9 M（改良后）常規(guī)使

3、用，改良后靈敏度較高樣品處理程序復(fù)雜，特異性不高 電化學(xué)分析電化學(xué)分析法法 10 6M-10 5 M能排除抗壞血酸的影響，重現(xiàn)性較好 靈敏度低,只是針對(duì)DA檢測(cè),仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳（CE）法）法 10-8 M（depends）分離高效,耗樣量少 靈敏度尚不高稀土熒光探稀土熒光探針?lè)ㄡ樂(lè)?0-8 M簡(jiǎn)便，可以與各種分離手段聯(lián)用靈敏度不夠高稀土熒光探針檢測(cè)稀土熒光探針檢測(cè)兒茶酚類(lèi)化合物的原理兒茶酚類(lèi)化合物的原理 單純的TbCl3，Tb-DCTA體系和DOPAC在實(shí)驗(yàn)用的波長(zhǎng)條件下(298nm,546.8nm)都沒(méi)有熒光信號(hào)，可見(jiàn)體系發(fā)光是由于形成了Tb-DCTADOPAC三重

4、絡(luò)合物并發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移得結(jié)果。DOPAC的熒光圖的熒光圖紅：激發(fā)波長(zhǎng)為279nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為298nmTbCl3的熒光圖的熒光圖紅：激發(fā)波長(zhǎng)為298nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為240nmTbDCTA熒光圖熒光圖玫紅：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm綠：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm（三重絡(luò)合物，TbDCTA濃度同上）綠：激發(fā)波長(zhǎng)為298nmTbDCTADOPAC體系熒光圖體系熒光圖綠：激發(fā)波長(zhǎng)為240nm紅：激發(fā)波長(zhǎng)為279nm藍(lán)：激發(fā)波長(zhǎng)為298nm1.三元絡(luò)合物的形成三元絡(luò)合物的形成 三元絡(luò)合物體系：三元絡(luò)合物體系：1.離子締合三元絡(luò)合物 2.金屬離子先后結(jié)合兩種配體形成三元絡(luò)合物 TbDCTACAs體系：體系：Tb與

5、DCTA先行絡(luò)合，然后Tb余下的空位再與CAs絡(luò)合，形成三重絡(luò)合體系 2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(1) 配體受激后,單重態(tài)（S1）有三種方式退激： a. 產(chǎn)生熒光的輻射躍遷(S1-S0) b. 系間竄躍(S1-T1) c. 無(wú)輻射躍遷回基態(tài)(ISC) 三重態(tài)（T 1）也有三種退激方式： a. 產(chǎn)生磷光的輻射躍遷(T1-S0) b. 通過(guò)無(wú)輻射轉(zhuǎn)移躍遷到Tb3的激發(fā)態(tài)(ET)，c. 無(wú)輻射躍遷回基態(tài)(T1S0)。2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(2) 分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)換效率的影響因素：1.配體最低的激發(fā)三重態(tài)（T1）能量高于Tb的5D4能級(jí)的能量2.能量轉(zhuǎn)移的速率大于三重態(tài)無(wú)輻

6、射退激的速率3.從配體激發(fā)單重態(tài)向三重態(tài)系間竄躍的速率和幾率相當(dāng)高2.三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理三元絡(luò)合物發(fā)光機(jī)理(3)兒茶酚胺的磷光發(fā)射波長(zhǎng)在409 nm417 nm，亦即其三重態(tài)（T1）的能量高于Tb3的5D 4能級(jí)約3800-4000 cm 1高量子產(chǎn)率和躍遷幾率能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)高達(dá)1010s1由水或解離的氧導(dǎo)致的配體三重態(tài)（T1）以及Tb3， 發(fā)光的猝滅也大大減少了。 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：稀土離子與第一配體的選擇： 1. Eu3 + EDTA體系 ； 2. Eu3phen體系； 小結(jié)： 最終棄用這兩個(gè)體系的原因，是其適用的pH范圍太低，難以使DA的羥基充分解離

7、形成三元絡(luò)合物。實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化 稀土離子與第一配體的選擇：稀土離子與第一配體的選擇： 3. Tb3 + EDTA體系（1）： Tb:EDTA1:1（濃度均為2 mmol/L）, pH11, ex300 nm，em545 nm,加入甲醇（分析純）、CsCl、TOPO等嘗試敏化,無(wú)法得到滿(mǎn)意 檢測(cè)限，DA為105 mol/L 小結(jié)： 目前研究最多的體系，適用的pH相對(duì)于前兩個(gè)體系有了很大提高，但是仍然未能達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：稀土離子與第一配體的選擇： 3. Tb3 + EDTA體系（2）： Tb:EDTA1:1（濃度均為2 mmo

8、l/L）, pH11, ex240 nm，em545 nm,出現(xiàn)遞減結(jié)果小結(jié)： 在ex240 nm，em545 nm,出現(xiàn)的Tb3特征波長(zhǎng)處的遞減結(jié)果，可能是由于在檢測(cè)條件下,TbEDTA體系能發(fā)出Tb3的特征熒光，而待測(cè)物與之形成三重絡(luò)合體系后,激發(fā)波長(zhǎng)紅移，亦即三重絡(luò)合體系的形成導(dǎo)致了一部分Tb3特征熒光的猝滅。 0.000000.000050.000100.000150.00020020406080100120140160180FluorCDA/M0.000000.000050.000100.000150.00020406080100120140160180FluorCDOPAC/MAC

9、DOPACFluro圖 BCDA-Fluro圖 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化稀土離子與第一配體的選擇：稀土離子與第一配體的選擇： 4. Tb3 + DCTA體系 ： 20C 時(shí)， Tb3與EDTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為17.93，而與DCTA的絡(luò)合常數(shù)lgK1為20.20* 因此本體系可以在更高pH下存在，更利于三重絡(luò)合物形成pH影響11.011.512.012.513.04142434445464748FluorpH20304050607080280300320340360380400420440460FluorVNaOH/ul0.4 mmol/L Tb3DCTA，2105 mol/L DOP

10、AC，橫坐標(biāo)為pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液（色譜純甲醇：重蒸水9：1），橫坐標(biāo)為5 ml樣品中10 mol/L NaOH的體積 表面活性劑的影響由于水分子對(duì)熒光有相當(dāng)?shù)拟缱饔?，體系又是在水相中，因此嘗試加入表面活性劑進(jìn)行改進(jìn)。期望熒光體系能夠被包裹在表面活性劑形成的膠束中得到保護(hù)，起到敏化作用。共嘗試加入了陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉，陽(yáng)離子表面活性劑溴代十二烷基三甲胺和非離子表面活性劑TOPO。都未起到期望的對(duì)體系的改善作用。甲醇含量影響0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液 ，NaOH fixed0

11、20406080100050100150200250300350400450Fluro甲 醇含量 （）重原子影響 重原子對(duì)于熒光體系有時(shí)也可起到敏化作用。實(shí)驗(yàn)嘗試向體系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入對(duì)體系的熒光有明顯得增強(qiáng)作用 ，最后選擇CsCl濃度為0.1 mol/L。 0.000.020.040.060.080.1080859095100105110115120125FluroCCS+/M加樣順序影響TbDCTA， 甲醇， NaOH， CsClTbDCTA， 甲醇， CsCl， NaOHTbDCTA， NaOH，甲醇， CsClTbDCTA， NaOH， C

12、sCl，甲醇Tb，DCTA， 甲醇， NaOH， CsClDCTA， 甲醇， Tb，NaOH， CsCl實(shí)驗(yàn)操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色譜純甲醇4.5 ml，混勻。在檢測(cè)前再加入待測(cè)物，用重蒸水定容至5 ml，在激發(fā)波長(zhǎng)為298 nm，發(fā)射波長(zhǎng)546.8 nm處用0.5 cm比色池測(cè)定熒光強(qiáng)度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 a. CDA Fluro圖 b. CDOPAC- Fluro圖 0.0000000.0000020.0000040.0000060.0000080501001

13、50200250FluroCDA/mol L-1 B Data1B0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008050100150200250300350400FluroCDOPAC/mol L-1 B Data1B實(shí)驗(yàn)結(jié)果 c. C鄰二酚 Fluro圖 d. C3，4二羥基苯甲酸Fluro圖 0.0000000.0000020.0000040.0000060.000008050100150200250FluroCCA/mol L1 B Data1B0.0000000.0000020.0000040.0000060.0000080100200300400500600700800FluroC3,4-二羥 基苯 甲 酸/mol L-1 B Linear Fit of Data1_B實(shí)驗(yàn)結(jié)果 被測(cè)物指標(biāo)多巴胺（DA）3,4二羥基苯乙酸（DOPAC）鄰二酚（兒茶酚）3,4二羥基苯甲酸線(xiàn)性范圍8108 8106mol/L8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)0.99880.99920.99670.9982檢測(cè)限5.2108 mol/L3.6108 mol/L5.7108 mol/L2.97108 mol/L 1.證明了CAs