微生物學(xué)檢驗(yàn)_大腸菌群計(jì)數(shù)

1、微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)大腸菌群coliforms：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。1、設(shè)備和材料：1.1 恒溫培養(yǎng)箱：36 ±1 。1.2 冰箱：2 5 。1.3 恒溫水浴箱：46 ±1 。1.4 天平：感量0.1 g。1.5 均質(zhì)器。1.6 無(wú)菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸頭。1.7 無(wú)菌錐形瓶：容量500 mL。1.8 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90 mm。1.9 pH 計(jì)或pH 比色管或精密pH 試紙。2、培養(yǎng)基和試劑2.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulf

2、ate Tryptose，LST）肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.1。2.2 煌綠乳糖膽鹽（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉湯：見(jiàn)附錄A 中A.2。2.3 磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)附錄A 中A.3。2.4 無(wú)菌生理鹽水：見(jiàn)附錄A 中A.4。2.5 無(wú)菌1 mol/L NaOH：見(jiàn)附錄A 中A.5。2.6 無(wú)菌1 mol/L HCl：見(jiàn)附錄A 中A.6。大腸菌群MPN 計(jì)數(shù)法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖。檢樣25 g(mL)樣品+225 mL 稀釋液，均質(zhì)10 倍系列稀釋選擇適宜 3 個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST 肉湯管36±1 48h±2h 不

3、產(chǎn)氣 產(chǎn)氣 BGLB 肉湯 36±1 48h±2h不產(chǎn)氣 產(chǎn)氣 大腸菌群陰性 大腸菌群陽(yáng)性 查 MPN 表 報(bào)告結(jié)果3、 操作步驟3.1 樣品的稀釋3.1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi),8000 r/min10000 r/min 均質(zhì)1 min2 min,制成1:10 的樣品勻液。3.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10 的樣品勻液。3.1.3 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6.57.5 之

4、間，必要時(shí)分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)。3.1.4 用1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無(wú)菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。3.1.5 根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1 mL 無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過(guò)程不得超過(guò)15 min。3.2 初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液

5、體樣品可以選擇原液），每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1 mL，則用雙料LST肉湯），36±1 培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ±1培養(yǎng)48 h±2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。3.4 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報(bào)告按3

6、.3確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（見(jiàn)附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。培養(yǎng)基和試劑A.1 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 成分胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化鈉 5.0 g 乳糖 5.0 g磷酸氫二鉀（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 2.75 g月桂基硫酸鈉 0.1 g 蒸餾水 1 000 mLpH 6.8±0.2 制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié) pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管5 mL -10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.2 煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 成分蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0

7、 g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL0.1%煌綠水溶液 13.3 mL 蒸餾水 800 mLpH 7.2±0.1 制法將蛋白胨、乳糖溶于約500 mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將20.0 g脫水牛膽粉溶于200 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7.07.5），用蒸餾水稀釋到975 mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0.1%煌綠水溶液13.3 mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1 000 mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管5 mL -10 mL。121 高壓滅菌15 min。A.3 磷酸鹽緩沖液A.3.1 成分磷酸二氫鉀（KH2PO4） 34.0 g 蒸餾水 500

8、mLpH 7.2A.3.2 制法貯存液：稱取34.0 g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液1.25 mL，用蒸餾水稀釋至1000 mL，分裝于適宜容器中，121 高壓滅菌15 min。A.4 無(wú)菌生理鹽水A.4.1 成分氯化鈉 8.5 g 蒸餾水 1000 mLA.4.2 制法稱取8.5氯化鈉溶于1000 mL蒸餾水中，121 高壓滅菌15 min。A.5 1 mol/L NaOHA.5.1 成分NaOH 40.0 g 蒸餾水 1000 mLA.5.2 制法稱取40 g氫氧化鈉溶于1000 mL蒸餾水中，1