附錄 蛋白質(zhì)測(cè)定法

1、附錄 蛋白質(zhì)測(cè)定法第一法凱氏定氮法1 鎢酸沉淀法 本法系通過測(cè)定供試品的總氮含量以及經(jīng)鎢酸沉淀去除蛋白的供試品濾液中的非蛋白氮含量，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。供試品溶液的制備 （1)總氮測(cè)定溶液的制備精密量取供試品1ml，用生理氯化鈉溶液準(zhǔn)確稀釋至每1ml含氮量約1mg。（2)非蛋白氮測(cè)定溶液的制備精密量取供試品2ml，加水14ml、10%鎢酸鈉溶液2ml、硫酸溶液（1.86100）2ml,搖勻，靜置30分鐘過濾，取濾液測(cè)定。測(cè)定法 精密量取總氮測(cè)定溶液1ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測(cè)定法（附錄 A）測(cè)定供試品中總氮含量。同時(shí)做空白對(duì)照。精密量取非蛋白氮測(cè)定溶液5ml，置凱氏定氮瓶中，照氮測(cè)定法（附錄

2、 A）測(cè)定供試品中非蛋白氮含量。按下式計(jì)算CTN（mg/ml）=（VX1-V0）×c×14.01×n×2 _V1CNPN（mg/ml）=（VX2-V0）×c×14.01×n×2 _V2 CPN（mg/ml）=CTN-CNPN供試品蛋白質(zhì)含量（%,g/ml）=CPN×6.25×100 _1000式中CTN為供試品溶液總氮含量，mg/ml;CNPN為供試品溶液非蛋白氮含量，mg/ml;VX1為供試品總氮測(cè)定溶液消耗酸滴定液的體積,ml;VX2為供試品非蛋白氮測(cè)定溶液消耗酸滴定液的體積，ml;V0為空

3、白試驗(yàn)消耗酸滴定液的體積，ml;c為硫酸滴定液的濃度，mol/L；CPN為供試品蛋白氮含量，mg/ml;n為供試品的稀釋倍數(shù)；V1為供試品總氮測(cè)定溶液的體積，ml；V2為供試品非氮測(cè)定溶液的體積，ml；14.01為氮的相對(duì)原子質(zhì)量；6.25 為常數(shù)（1g氮相當(dāng)于6.25g蛋白質(zhì)）?！靖阶ⅰ浚?)供試品蛋白質(zhì)含量如超過10%（g/ml），除蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)適當(dāng)加大供試品稀釋倍數(shù)，10%鎢酸鈉溶液及硫酸溶液用量相應(yīng)地按比例增加，使溶液中的鎢酸濃度仍保持1%。（2)總氮測(cè)定和非蛋白氮測(cè)定可用同一空白對(duì)照。2 三氯醋酸沉淀法（新增）本法系將供試品經(jīng)三氯醋酸沉淀，通過測(cè)定該沉淀中的蛋白氮含量，計(jì)算出蛋白質(zhì)的含

4、量。測(cè)定法 精確量取適宜體積的供試品（每1ml含蛋白質(zhì)為4-10mg）于適宜的尖底離心管中，加等體積的12%三氯醋酸（12100）混勻，靜置30分鐘后，離心（4000轉(zhuǎn)/分鐘），棄上清，用約3ml水分?jǐn)?shù)次將沉淀洗入凱氏定氮瓶中，照氮測(cè)定法（附錄VI A）測(cè)定供試品中總氮含量，同時(shí)做空白對(duì)照。按下式計(jì)算： （VX-V0）×C×14.01×2供試品蛋白質(zhì)含量（mg/ml）= ×6.25 V 式中VX 為供試品消耗酸滴定液的體積，ml; V0為空白試驗(yàn)消耗酸滴定液的體積，ml; C為硫酸滴定液的濃度，mol/L; V 為供試品的體積，ml。第二法Lowry法本

5、法用于微量蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物, 此復(fù)合物加入酚試劑后, 產(chǎn)生藍(lán)色化合物, 該藍(lán)色化合物在650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計(jì)算供試品的蛋白質(zhì)含量。試劑（1)酚試劑 取鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g，置1500ml蒸餾瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、鹽酸100ml，上連回流管(使用木塞或錫紙包裹的橡皮塞)微沸回流10小時(shí)。取下回流管，加入硫酸鋰150g、水50ml、溴液幾滴，煮沸約15分鐘，驅(qū)除過量的溴。冷卻，加水至1000ml，過濾，為酚試劑貯備

6、液。酚試劑貯備液 用氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）測(cè)定酸濃度，然后加水稀釋至相當(dāng)于1mol/L鹽酸濃度。（2)堿性銅溶液 取0.1mol/L酒石酸鉀溶液與0.04mol/L硫酸銅溶液各0.5 ml，4%碳酸鈉溶液與0.8%氫氧化鈉溶液各25 ml，搖勻，即得。本液應(yīng)臨用配制。（3)氫氧化鈉滴定液（0.5mol/L）的配制及標(biāo)定 取氫氧化鈉適量，加水?dāng)嚢枋谷芙獬娠柡腿芤?，冷卻后，置聚乙烯塑料瓶中，靜止數(shù)日，澄清后，取澄清的氫氧化鈉飽和溶液28ml，加新煮沸后冷卻的水，使成1000ml，搖勻。取在105干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀約3g，精密稱定，加新沸過的冷水50ml，振搖，使其盡量溶解；

7、加酚酞指示劑2滴，用本液滴定；在接近終點(diǎn)時(shí)，應(yīng)使鄰苯二甲酸氫鉀完全溶解，滴定至溶液顯粉紅色。每1ml氫氧化鈉滴定液相當(dāng)于102.1mg的鄰苯二甲酸氫鉀。根據(jù)本液的消耗量與鄰苯二甲酸氫鉀的取用量，算出本液的濃度。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備 取人血白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品一支，用水定量稀釋至每1ml含1mg，作為貯備液。精密量取貯備液2.5ml置25ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即為每1ml含100g的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。測(cè)定法 精密量取一定體積供試品（含蛋白質(zhì)50g左右）置試管內(nèi)，加水至1ml，加堿性銅溶液5ml,搖勻，室溫放置10分鐘, 快速加入酚試劑0.5 ml，搖勻，室溫放置30分鐘，顯色后，照紫外-見分光

8、光度法（附錄 A），在波長650nm處測(cè)定吸光度（呈色后，如發(fā)現(xiàn)渾濁，經(jīng)每分鐘3000轉(zhuǎn)離心15分鐘后，取上清液測(cè)定）。精密量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別置于試管中，自“加水至1ml”起，同法操作。準(zhǔn)確量取水1ml，自“加堿性銅溶液5ml”起，同法操作，作空白對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的蛋白質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)其吸光度，求直線回歸方程；將測(cè)得供試品的吸光度代入直線回歸方程，即得供試品的蛋白質(zhì)含量。第三法 雙縮脲法本法系依據(jù)蛋白質(zhì)肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，利用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液作對(duì)照，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定供試品蛋白

9、質(zhì)含量。試劑 雙縮脲試劑。 取硫酸銅（CuSO4·5H2O）3.0g、酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O）9.0g、碘化鉀5.0g、氫氧化鈉24g，加水溶解并稀釋至1000ml，搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備 精密量取人血白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品適量，用水定量稀釋成每1ml 含50mg的溶液。供試品溶液的制備 精密量取適量的供試品，加水制成每1ml約含50mg的溶液。測(cè)定法 分別精密量取供試品溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液各0.05ml置玻璃試管中，分別加雙縮脲試劑4.0ml，混勻，置37水浴中30分鐘，照紫外-可見分光光度法（附錄 A），在波長540nm處測(cè)定吸光度。另精密量取水0.05ml，自