c-myb基因反義寡核苷酸對K562細(xì)胞作用的研究

1、    c-myb基因反義寡核苷酸對K562細(xì)胞作用的研究        為研究慢性髓細(xì)胞白血病(CML)反義核酸的治療效果，我們以CML細(xì)胞株K562為實(shí)驗(yàn)對象，研究c-myb基因硫代磷酸反義寡聚脫氧核苷酸對K562細(xì)胞的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。材料和方法1細(xì)胞株K562細(xì)胞由福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所提供。培養(yǎng)條件：含體積分?jǐn)?shù)為15滅活胎牛血清(Gibco)及50IU/ml青霉素、50g/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)液(pH7.27.4)，置37、體積分?jǐn)?shù)為5CO2、完

2、全飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2反義寡核苷酸的合成反義寡聚脫氧核苷酸是由本所合成，為防核酸酶降解，采用二硫化四乙基秋蘭姆(tetraethylthiuramclisulfide,TETD)加以修飾，形成硫代磷酸反義寡聚脫氧核苷酸，經(jīng)OPC柱純化、冷凍干燥后用RPMI1640培養(yǎng)液配制成濃度為0.35mol/L備用。c-myb基因反義寡聚脫氧核苷酸的序列是根據(jù)人c-myb基因cDNA序列設(shè)計(jì)，同時(shí)設(shè)計(jì)c-myb基因正義寡聚脫氧核苷酸為對照。其序列見表1。 表1反義寡核苷酸及引物的序列引物序列（5'3'）c-myb基因密碼子27：正義GCCCGAAGACCCCGGCAC密碼子27：反義G

3、TGCCGGGGTCTTCGGGC-actinmRNA引物AGTGGGGCGCCCCAGGCACCA-actinmRNA引物BCTCCTTAATGTCACGCACGATTTCabl引物GGCTTCACTCAGACCCTGAGGbcr引物AGGGTGCACAGCCGCAACGGC3反義寡核苷酸與細(xì)胞共培養(yǎng)取對數(shù)生長期的細(xì)胞調(diào)成濃度為104/ml，置96孔培養(yǎng)板上每孔0.2ml，實(shí)驗(yàn)設(shè)反義c-myb組、正義c-myb組及空白對照組。反義寡核苷酸終濃度為5，10，20mol/L，置37、體積分?jǐn)?shù)為5CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天倒置顯微鏡下進(jìn)行活體觀察，并取部分細(xì)胞懸液用4g/L臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，

4、取活細(xì)胞作K562細(xì)胞集落形成(CFU-K562)實(shí)驗(yàn)。4CFU-K562培養(yǎng)濃度為10mol/L反義及正義寡核苷酸作用的細(xì)胞，直接以終濃度為8g/L甲基纖維素在24孔培養(yǎng)板上進(jìn)行CFU-K562培養(yǎng)，每孔1ml，細(xì)胞數(shù)為300個(gè)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)條件同上，第8天進(jìn)行集落計(jì)數(shù)。5p210bcr/abl檢測細(xì)胞經(jīng)反義及正義寡核苷酸作用后，以0.25mol/LPBS清洗2次，調(diào)細(xì)胞濃度為106/ml，加入1400bcr單抗(SantaGlu產(chǎn)品)，以101混合，4孵育半小時(shí)，加入等量的FITC標(biāo)記的二抗，同樣條件作用30分鐘，經(jīng)BryteHS型流式細(xì)胞儀測定活細(xì)胞表面p210bcr/abl蛋

5、白表達(dá)陽性率。實(shí)驗(yàn)以不經(jīng)處理的K562細(xì)胞為陽性對照，以不加一抗為陰性對照。6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）半定量檢測bcr-abl mRNA表達(dá)收集經(jīng)終濃度為10mol/L的反義及正義寡核苷酸作用48小時(shí)的K562細(xì)胞，用RNA提取液(TRIzol)提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計(jì)進(jìn)行RNA定量，取1gRNA用引物OligodT15反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)一對引物，PCR擴(kuò)增含bcr/abl融合位點(diǎn)在內(nèi)的332bp特異片段，?actin作為內(nèi)參照，引物序列見表1，兩對引物同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用20g/L瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠像分析儀分析PCR結(jié)果。結(jié)

6、果1反義寡核苷酸對K562細(xì)胞生長曲線的影響K562細(xì)胞經(jīng)c-myb基因序列特異的反義寡核苷酸處理后，當(dāng)濃度達(dá)一定量(5mol/L)時(shí)，細(xì)胞生長受抑制，倍增時(shí)間延長。抑制程度與劑量呈正相關(guān)(見1)，當(dāng)終濃度為10mol/L時(shí)，24小時(shí)細(xì)胞生長抑制率為45.3，48小時(shí)為73.8，而72小時(shí)為61.6，作用48小時(shí)效果最佳。K562細(xì)胞經(jīng)濃度為10mol/L的c-myb基因反義核酸作用后72小時(shí)臺盼藍(lán)拒染率>95，培養(yǎng)至第5天死亡細(xì)胞開始增多。1不同濃度c-myb基因反義寡核苷酸作用后K562細(xì)胞生長曲線的變化2反義寡核苷酸對K562細(xì)胞CFU-K562的影響經(jīng)反義寡核苷酸處理后的K562

7、細(xì)胞集落形成率見2，作用48小時(shí)，抑制率達(dá)43.27，與正義組及空白組比較，差異有顯著性意義(P0.01)，而且反義組集落體積較小，細(xì)胞數(shù)較少。2c-myb基因反義寡核苷酸作用后K562細(xì)胞集落形成率的變化3反義寡核苷酸處理后細(xì)胞P210bcr/abl表達(dá)情況經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測K562細(xì)胞表面P210bcr/abl陽性率為(99.3±0.5)，而實(shí)驗(yàn)組反義寡核苷酸終濃度達(dá)10mol/L時(shí)，作用24小時(shí)P210bcr/abl明顯下降，直至第5天，陽性率仍很低;若濃度為5mol/L時(shí)，P210bcr/abl陽性率隨時(shí)間延長逐漸回升，而正義組未見明顯改變(見表2)。4反義寡核苷酸處理后細(xì)胞b

8、cr-abl mRNA表達(dá)情況兩對引物進(jìn)行RT-PCR后，可以獲得332bp(bcr/abl)及540bp(-actin)兩條帶，從凝膠像可以看出，反義寡核苷酸處理的K562細(xì)胞的bcr/abl帶較正義組及空白對照組的bcr/abl帶亮度明顯減弱。凝膠像分析儀分析電泳結(jié)果，反義寡核苷酸實(shí)驗(yàn)組的bcr/abl與-actin的比值為0.195，而正義組為0.436，空白組為0.570。討論CML的遺傳學(xué)特征是具有bcr/abl融合基因，表達(dá)酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)P210bcr/abl。c-myb基因表達(dá)的產(chǎn)物與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，在造血系統(tǒng)的惡性腫瘤中存在表達(dá)異常，Bedi等1研究發(fā)現(xiàn)，在bcr/a

9、bl基因上調(diào)區(qū)至少有1個(gè)myb蛋白結(jié)合位點(diǎn)，后者可能對bcr/ablmRNA表達(dá)有調(diào)節(jié)作用。因此選擇myb基因?yàn)镃ML反義核酸治療的靶基因，對CML細(xì)胞基因治療可能具有雙重作用。我們合成與c-myb基因起始區(qū)第27密碼子互補(bǔ)的特異反義寡聚脫氧核糖核酸，經(jīng)硫代磷酸化修飾后，與K562細(xì)胞作用，發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)胞增殖效果好，它使細(xì)胞增殖速度變慢、倍增時(shí)間延長，這進(jìn)一步證實(shí)c-myb基因與細(xì)胞增殖有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞集落形成率變低，體積變小。在作用5天之內(nèi)，普通光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，死亡現(xiàn)象不明顯。說明c-myb基因反義寡核苷酸對K562細(xì)胞并非直接毒性作用，而是增殖抑制為主。為進(jìn)一步研究c-m

10、yb基因反義寡核苷酸對K562細(xì)胞作用，我們采用流式細(xì)胞儀測定活細(xì)胞表面P210bcr/abl表達(dá)，避免免疫組織化學(xué)染色時(shí)死亡細(xì)胞參與其中而帶來假陰性的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)反義寡核苷酸濃度達(dá)10mol/L時(shí)，細(xì)胞表面P210bcr/abl表達(dá)明顯受抑制，第5天仍未恢復(fù)，而濃度較低時(shí)，可能是由于反義寡核苷酸作用的隨機(jī)性，部分細(xì)胞未受作用或者是細(xì)胞內(nèi)反義寡核苷酸濃度較低，細(xì)胞未受抑制而繼續(xù)增殖，所以P210bcr/abl陽性表達(dá)逐漸回升，第5天達(dá)45.2。反義寡核苷酸作用后bcr/ablmRNA水平，亦見明顯下降，反義組的bcr/ablmRNA與-actin比值較空白組下降了65.8。由此可見，c-

11、myb基因反義核酸對K562細(xì)胞的作用可能既有增殖抑制又有調(diào)節(jié)bcr/ablmRNA表達(dá)的作用。c-myb基因可以作為CML基因治療中的靶基因考慮。表2c-myb基因反義寡核苷酸作用后不同時(shí)間K562細(xì)胞表面P210bcr/abl蛋白表達(dá)陽性率（，±s）組別濃度實(shí)驗(yàn)次數(shù)第1天第2天第3天第4天第5天反義寡核苷酸組5.0mol/L311.2±2.116.8±1.422.9±3.031.8±2.545.2±5.010.0mol/L30.7±0.31.4±0.71.7±0.41.8±0.61.7±0.3正義寡核苷酸組10.0mol/L396.3±2.197.5±0.896.8±1.797.7±1.398.0±0.9作者單位：350001福州，福建省血液病研究所、福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院參考文獻(xiàn)：1Bedi A, Zehnbauer BA, Collec