三氧化二砷對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤血管生成素2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

1、三氧化二砷對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤血管生成素2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響         11-01-09 11:37:00     編輯：studa20              作者：肖延風(fēng)，劉陜西，鄔德東，陳璽，任利芬【摘要】  目的 研究三氧化二砷(As2O3)對(duì)腫瘤血管生成素2(Ang2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的影響。方

2、法 用人胃腺癌細(xì)胞株SGC7901接種30只裸鼠皮下，建立實(shí)體瘤模型；然后隨機(jī)分為As2O3高劑量(5mg/kg)、低劑量(2.5mg/kg)治療組和對(duì)照組，每組各10只。治療組接受As2O3腹腔注射10d，對(duì)照組注射生理鹽水。測(cè)量腫瘤體積并計(jì)算抑瘤率；免疫熒光標(biāo)記CD31并計(jì)算血管密度；免疫組化方法測(cè)定Ang2的表達(dá)；免疫熒光激光共聚焦檢測(cè)VEGF的表達(dá)。結(jié)果 砷劑治療可抑制瘤塊生長(zhǎng)，2.5mg/kg和5mg/kg As2O3治療組的抑瘤率分別為30.33%和50.85%。As2O3治療組的微血管密度(MVD)、VEGF熒光表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。Ang2主要在血管內(nèi)

3、皮細(xì)胞的胞漿中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，可清晰標(biāo)記腫瘤內(nèi)的血管；對(duì)照組和As2O3治療組血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang2表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯差異。結(jié)論 As2O3對(duì)Ang2表達(dá)無(wú)明顯影響，在As2O3治療抑制瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)的情況下，Ang2表達(dá)可促進(jìn)血管的退化。Ang2主要在新生的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，故可能作為新生血管的標(biāo)記物，成為腫瘤新生血管研究的新指標(biāo)。 【關(guān)鍵詞】  三氧化二砷；血管生成素2；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；血管生成；胃癌；血管密度    ABSTRACT: Objective  To investigate the effect of arsenic trioxid

4、e (As2O3) on expression of angiopoietin2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in cancer. Methods  The solid tumor model was formed in nude mice with gastric cancer cell line SGC7901. The 30 nude mice were randomly divided into the two arsenictreated groups (2.5mg/kg and 5mg/kg) and con

5、trol group. As2O3 was injected to mice in the treated groups for 10 days; the same volume of saline solution was injected to the control group. The volume of gastric tumor xenografts was measured and counted for tumor growth inhibition (TGI). Microvessel density (MVD) labeled by CD31 was measured wi

6、th immunofluorescence. Expression of angiopoietin2 was detected by immunohistochemistry, and expression of VEGF was detected by immunofluorescence laser confocal technology. Results  Tumor growth inhibitions were 30.33% and 50.85% in 2.5mg/kg and 5mg/kg As2O3, respectively. Decrease of MVD appe

7、ared in As2O3treated tumors compared with that in the control group. The fluorescence intensity level of VEGF in tumor cells was lower significantly than that in the arsenictreated groups. Angiopoietin2 was mostly expressed in endothelial cells in tumors. There was no difference in expression level

8、of angiopoeitin2 between arsenictreated groups and the control group. Conclusion  As2O3 does not affect the expression of angiopoietin2. Angiopoietin2 may induce vessel regression, and VEGF expression is decreased by As2O3 in tumor. Angiopoietin2 may become a new indicator in study on angiogene

9、sis in tumor.    KEY WORDS: arsenic trioxide; angiopoietin2; vascular endothelial growth factor; angiogenesis; gastric cancer; microvessel density     有多種細(xì)胞因子通過(guò)不同的受體參與血管生成過(guò)程，其中特異性作用于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子有兩類(lèi)：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管生成素(angiopoietin,

10、 Ang)。VEGF促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而Ang則支持細(xì)胞的募集。Ang與VEGF 協(xié)同作用，參與調(diào)節(jié)新生血管生成。Ang家族是唯一含受體激動(dòng)劑及抑制劑的促血管生成因子，目前發(fā)現(xiàn)4個(gè)成員，其中Ang1和Ang2已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤血管生成關(guān)系密切，而Ang3和Ang4與腫瘤血管新生的相關(guān)研究較少。目前，研究認(rèn)為Ang1的表達(dá)與腫瘤血管形成的多少關(guān)系不大；而Ang2表達(dá)是腫瘤血管新生起始及加強(qiáng)的因素，與腫瘤血管形成數(shù)目、臨床分期及預(yù)后關(guān)系密切12。Ang2和VEGF對(duì)腫瘤血管新生均起重要作用，而Ang2對(duì)血管的調(diào)節(jié)呈VEGF依賴(lài)性。    砷是一種氮族金屬元素，以3價(jià)或5

11、價(jià)形式廣泛存在。砷化物砒霜(主要成分為As2O3)作為中藥使用已有上千年歷史，用于腫瘤治療也有幾百年的歷史。我國(guó)學(xué)者首先用As2O3治療急性粒細(xì)胞白血病獲得顯著療效。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)腫瘤血管生成有抑制作用。本研究建立人胃腺癌裸鼠移植瘤模型，采用As2O3腹腔注射治療，觀察瘤組織中Ang2和VEGF的表達(dá)情況，旨在探討As2O3對(duì)腫瘤Ang2和VEGF表達(dá)的影響，以闡明As2O3抑制腫瘤血管生成的作用機(jī)制。    1  材料與方法    1.1  動(dòng)物模型的建立  裸鼠30只，雄性，5周齡，體重1

12、921g，于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。人胃腺癌株SGC7901細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(10d)，用RPMI1640調(diào)整細(xì)胞密度至2×107/mL；取該細(xì)胞懸液0.2mL(4×106個(gè)SGC7901細(xì)胞/只)接種于每只裸鼠右后肢背部皮下。    1.2  實(shí)驗(yàn)分組和藥物干預(yù)  裸鼠接種SGC7901細(xì)胞后，隔天觀察一次，瘤塊變硬，且長(zhǎng)徑大于0.5cm視為成瘤。于接種腫瘤細(xì)胞第10天，觀察每只裸鼠均形成瘤節(jié)。于接種腫瘤細(xì)胞第11天按隨機(jī)分組的原則將30只裸鼠分為As2O3低劑量治療組(2.5mg/kg組)、

13、高劑量治療組(5mg/kg組)和對(duì)照組。分別腹腔注射As2O3 2.5mg/kg、5mg/kg及生理鹽水0.2mL，每天1次、連續(xù)給藥10d。    1.3  取材及固定  于末次給藥次日(即治療第11天)，腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，迅速取下瘤塊并稱(chēng)重后放入40g/L多聚甲醛溶液中固定，供制備冰凍切片和石蠟切片用。另外，取肝腎組織制備石蠟切片，HE染色，觀察組織形態(tài)學(xué)變化。    1.4  抑瘤率(tumor growth inhibition, TGI)的計(jì)算  于治療開(kāi)始前、治療第6天、第

14、11天分別測(cè)量瘤塊的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)，瘤塊體積(mm3)=ab2/2，抑瘤率=(1-治療組平均瘤塊體積/對(duì)照組平均瘤塊體積)×100%。    1.5  血管生成素2表達(dá)的檢測(cè)  采用免疫組化法，步驟如下：脫蠟、脫水，取出制備好的石蠟切片在以下液體中浸泡：二甲苯15min二甲苯15min無(wú)水乙醇10min95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10min80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇10min；純水浸泡，2×5min；滴加H2O2，置濕盒中室溫下孵育10min；純水沖洗，PBS浸泡5min；滴加山羊血清，37下孵育20min，傾去，勿洗；滴加一

15、抗，為兔抗人Ang2多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz生產(chǎn))，37條件下孵育3h；PBS沖洗，3×5min；滴加羊抗兔IgG，37條件下孵育15min；PBS沖洗，3×5min；滴加過(guò)氧化酶標(biāo)記的辣酶卵白素工作液，37條件下孵育15min；PBS沖洗，3×5min；顯色劑(DAB)顯色10min；自來(lái)水沖洗，浸泡2×5min；脫水、透明，將以上玻片分別在以下液體中浸泡：80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇5min95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇5min無(wú)水乙醇10min無(wú)水乙醇10min二甲苯10min二甲苯10min；封片：將中性樹(shù)膠滴于載玻片上，緩慢放下蓋玻片封片。將制作

16、好的玻片置于光鏡下，在400倍和1000倍下觀察結(jié)果，在血管熱點(diǎn)區(qū)取圖，攝像。   1.6  CD31和VEGF表達(dá)的檢測(cè)  采用免疫熒光法，步驟如下：取出已經(jīng)用40g/L多聚甲醛固定好的冰凍切片，置于室溫下30min，然后蒸餾水浸泡5min，PBS浸泡5min；1g/LTritonX100打孔10min；PBS沖洗3×5min；滴加封閉血清，37條件下孵育20min，傾去，勿洗；分別滴加稀釋的一抗兔抗人VEGF多克隆抗體(Labvision, USA)；大鼠抗小鼠CD31一抗(Biolegend, USA)4過(guò)夜；PBS沖洗3×5m

17、in；分別滴加FITC標(biāo)記的綿羊抗兔熒光二抗(Sigma)和TRITC標(biāo)記的羊抗大鼠熒光二抗(Sigma)，37條件下反應(yīng)1h；PBS沖洗3×10min；甘油封片。    1.7  激光共聚焦分析  用激光共聚焦顯微鏡(TCS SP2，德國(guó)Leica)，450500nm波長(zhǎng)激發(fā)，515565nm波長(zhǎng)觀察結(jié)果。在每個(gè)腫瘤標(biāo)本上取10個(gè)圖像，用LeiCa Confoncal圖片處理軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，取均值表示該標(biāo)本的熒光強(qiáng)度。    1.8  血管計(jì)數(shù)  在熒光顯微鏡(德國(guó)ZEISS)下觀察結(jié)果。能被CD31熒光著色且分界清楚、并能與臨床血管、腫瘤細(xì)胞及其他結(jié)締組織區(qū)分的內(nèi)皮細(xì)胞作為單個(gè)計(jì)數(shù)微血管。選擇微血管熱點(diǎn)區(qū)(neovascular hot spot)，光鏡40倍視野下選擇20個(gè)計(jì)數(shù)其內(nèi)微血管數(shù)，取平均數(shù)即為微血管密度。    1.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  使用SPSS13.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(&#