p38絲裂原活化蛋白激酶在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的磷酸化及其意義(一)

1、p38絲裂原活化蛋白激酶在大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后的磷酸化及其意義(一)    【摘要】 目的： 觀探討大鼠視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化及其意義. 方法： 采用升高眼內(nèi)壓的方法，制作實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜缺血再灌注大鼠模型. 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組（n=6）和缺血再灌注組（n=24），其中缺血再灌注組又分為再灌注后2，12，24，72 h等4個(gè)時(shí)間段（每時(shí)間段6只）. 應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中p38 MAPK及磷酸化p38 MAPK （pp38 MAPK）蛋白的表達(dá)變化. 結(jié)果：

2、 p38 MAPK在缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜組織內(nèi)的表達(dá)保持相對(duì)恒定，與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的變化（P>0.05）. pp38 MAPK的表達(dá)水平在缺血再灌注組12 h時(shí)即有明顯升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，72 h時(shí)仍維持較高的表達(dá)水平，與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)著差異（P0.01）. 結(jié)論： p38 MAPK信號(hào)通路的激活可能與缺血再灌注所造成的視網(wǎng)膜損傷有密切關(guān)系. 【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜；再灌注損傷；p38絲裂原活化蛋白激酶類(lèi)；印跡法，蛋白質(zhì)；大鼠0引言視網(wǎng)膜缺血再灌注（retina ischemiareperfusion injury）損傷主要發(fā)生在視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、未成熟的視網(wǎng)

3、膜病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜血管阻塞所致的缺血性疾病中，它們均可造成不同程度的視網(wǎng)膜缺血. 在缺血再通后，視網(wǎng)膜反而受到更為嚴(yán)重的損傷，造成視功能下降1- 2. 因此，加強(qiáng)對(duì)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷機(jī)制的研究是非常重要的. 目前視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全闡明，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠的視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型，觀察絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）家族成員之一的p38 MAPK蛋白在缺血再灌視網(wǎng)膜中的表達(dá)以及其磷酸化的時(shí)相變化，探索p38 MAPK在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的可能作用，為臨床治療視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷類(lèi)疾病提供理論

4、依據(jù).1材料和方法1.1材料成年健康Wistar大鼠30只，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 雌雄不拘，體質(zhì)量270300 g，室溫環(huán)境飼養(yǎng). 小鼠抗p38 MAPK及小鼠抗磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；山羊抗actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗小鼠或山羊二抗購(gòu)自Chemicon公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、PVDF膜購(gòu)及Hyperfilm膠片自美國(guó)Amersham公司；蛋白質(zhì)提取及濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)BioRad公司.1.2方法1.2.1視網(wǎng)膜缺血再灌注模型的建立動(dòng)物隨機(jī)分成兩組：正常對(duì)照

5、組（6只）和缺血再灌注組（24只）. 缺血再灌注組又分為再灌注后2, 12, 24, 72 h等4個(gè)時(shí)間段（每時(shí)間段6只大鼠）. 以前房灌注升高眼壓的方法制備大鼠視網(wǎng)膜缺血. 再灌注損傷模型，具體方法為： 大鼠以水合氯醛麻醉(400 mg/kg)，將生理鹽水瓶連接輸液器，升高輸液瓶至于大鼠眼垂直距離為150 cm左右處，灌注壓力達(dá)到110 mm Hg (14.63 kPa). 將連接輸液器的7號(hào)頭皮針自大鼠顳側(cè)角膜緣穿刺入前房，手術(shù)顯微鏡直視下可見(jiàn)灌注壓平衡后，視網(wǎng)膜蒼白水腫，表明視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈供血已被完全阻斷. 60 min后降低液瓶高度至27 cm以下(20 mm Hg)，此時(shí)可見(jiàn)視網(wǎng)膜變

6、紅，表明視網(wǎng)膜血管重新開(kāi)放，已形成再灌注. 此時(shí)拔出前房灌注針頭，再灌注計(jì)時(shí)開(kāi)始.1.2.2視網(wǎng)膜內(nèi)p38MAPK和pp38MAPKA的檢測(cè) 視網(wǎng)膜組織蛋白質(zhì)的提?。赫?duì)照組動(dòng)物及再灌注后第2, 12, 24, 72 h的動(dòng)物以水合氯醛麻醉，快速取雙側(cè)眼球，分離出視網(wǎng)膜，液氮中速凍. 加入裂解緩沖液（0.15 mol/L NaCl, 0.05 mol/L Tris, 0.1 mg/L SDS，0.1 mg/L苯甲磺酰氟，1 g/L抑蛋白酶肽，1 mg/L NP40）. 勻漿，冰上裂解30 min，4 12000 g離心20 min，吸上清，-70保存. 蛋白質(zhì)SDSPAGE及電轉(zhuǎn)?。河玫鞍锥?/p>

7、量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取20 g蛋白，進(jìn)行125 g/L的聚丙烯酰胺凝膠電泳. 電泳結(jié)束后，用BioRad半干電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含50 mg/L脫脂奶粉的PBST溶液（0.2 mmol/L PBS，0.02 g/L吐溫20）封閉，室溫2 h. Western Blot檢測(cè)：分別加入p38 MAPK（12000）， pp38 MAPK（12500）和actin（15000）抗體，室溫過(guò)夜. PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP結(jié)合的羊抗小鼠IgG（15000）或驢抗山羊IgG（15000），室溫孵育2 h. PBST洗膜后，加入ECL顯色劑，置暗室曝光.

8、 曝光后的膠片進(jìn)行顯影、定影，用UVP凝膠成像系統(tǒng)對(duì)膠片上的條帶進(jìn)行掃描分析.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用Labworks軟件對(duì)各陽(yáng)性條帶的密度進(jìn)行測(cè)量，測(cè)得的p38 MAPK和pp38 MAPK陽(yáng)性條帶的密度與相應(yīng)的actin條帶密度的比值作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量，采用SPSS10.1分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析以及兩兩比較的Dunnettt檢驗(yàn).2結(jié)果Western blot顯示，在正常大鼠視網(wǎng)膜中檢測(cè)到了pp38 MAPK, p38MAPK和actin蛋白的表達(dá)，其中p38 MAPK和actin有較高的表達(dá)水平，而pp38 MAPK僅有微弱的表達(dá)（圖1）. 作為內(nèi)參照的actin在正常海馬組織和缺血再

9、灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜中的表達(dá)水平相當(dāng)，表明在實(shí)驗(yàn)中所加的蛋白量基本一致. p38 MAPK在缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜內(nèi)的表達(dá)保持相對(duì)恒定，與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）. pp38 MAPK的表達(dá)水平在再灌注后2 h時(shí)有輕度增加，但與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異. 其表達(dá)水平在再灌注12 h時(shí)明顯升高，24 h時(shí)達(dá)到高峰，72 h時(shí)仍維持較高的表達(dá)水平，與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01），分別是其在正常組海馬組織中表達(dá)水平的3.9, 5.8和3.4倍（圖1, 2）.圖1正常對(duì)照組（C）和缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)pp38 MAPK，p38 MAPK和

10、actin蛋白的表達(dá)（略）bP0.01 vs正常對(duì)照.圖2正常對(duì)照組和缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)水平（略）3討論視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷是眼科臨床很常見(jiàn)的病理生理過(guò)程. 由于供應(yīng)視網(wǎng)膜血液的中央動(dòng)脈為終末動(dòng)脈，因此視網(wǎng)膜缺血及循環(huán)障礙，會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜嚴(yán)重?fù)p傷. 以往觀點(diǎn)認(rèn)為，恢復(fù)血液再灌注是挽救視網(wǎng)膜缺血的重要途徑. 但近年的研究表明，視網(wǎng)膜在經(jīng)歷一定時(shí)間（60 90 min）的缺血后其功能并無(wú)變化，但是在再灌注后卻出現(xiàn)明顯的功能障礙，甚至出現(xiàn)不可逆的損傷，這就是視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷. 大量的研究表明，視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜

11、，是多種因素綜合作用的結(jié)果，如氧自由基的損傷、微血管的損傷、白細(xì)胞的作用和鈣超載等，但是有關(guān)的分子機(jī)制尚不清楚3.MAPK在許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和受體激活早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件中起關(guān)鍵作用. 在受到刺激后，MAPK的蘇氨酸和酪氨酸殘基被磷酸化，激活它們內(nèi)在的激酶活性，啟動(dòng)一系列的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路. p38 MAPK是MAPK家族的主要成員之一，參與了神經(jīng)細(xì)胞的分化、存活等生理過(guò)程. 以往的研究還表明p38 MAPK與包括腦缺血、缺氧等多因素所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷有密切關(guān)系4，但是p38 MAPK的激活在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的作用目前還存在爭(zhēng)論. 本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到缺血再灌注大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)p38 MA

12、PK的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)沒(méi)有變化，但是pp38 MAPK的表達(dá)卻在再灌注后12 h明顯升高，24 h達(dá)到最高水平，72 h時(shí)仍然有很高的水平. 上述結(jié)果表明在缺血再灌注損傷后，視網(wǎng)膜組織內(nèi)的p38 MAPK被激活，表現(xiàn)為磷酸化水平增高，提示p38 MAPK的活化在視網(wǎng)膜的缺血再灌注損傷中可能發(fā)揮著作用. 研究表明，視網(wǎng)膜在缺血再灌注損傷后，出現(xiàn)萎縮，視網(wǎng)膜細(xì)胞明顯減少. 視網(wǎng)膜細(xì)胞的減少主要是在內(nèi)五層，這五層主要為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層，其中包含的主要細(xì)胞為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和水平細(xì)胞5. 既往研究報(bào)道，p38 MAPK主要表達(dá)于視網(wǎng)膜的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞6. p38 MAPK的磷酸化

13、在上述兩種細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程中具有重要作用. 那么，在視網(wǎng)膜缺血在灌注損傷后，p38 MAPK通路的激活發(fā)揮著何種作用，尚不清楚. 有研究提示，p38 MAPK抑制劑SB203580能夠有效抑制視神經(jīng)損傷所導(dǎo)致的視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的凋亡7. 還有研究表明，鈣通道阻滯劑尼莫地平對(duì)缺血再灌注損傷的視網(wǎng)膜具有保護(hù)作用，而且該保護(hù)作用可通過(guò)抑制p38 MAPK mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)8.結(jié)合p38 MAPK主要表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型，我們推測(cè)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后p38 MAPK通路的激活可能與視網(wǎng)膜的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞和節(jié)細(xì)胞的損傷有密切的關(guān)系，進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中.【參考文獻(xiàn)】1 Osborne NN, Casson

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