十哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗

1、十一、哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗In Vivo Mammalian Bone Marrow Cell Chromosome Aberration Test1 范圍 本規(guī)范規(guī)定了哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于檢測化妝品原料及其產品的遺傳毒性。2 規(guī)范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 475, April 1997 )3 試驗目的 本試驗是一項致突變性試驗，檢測整體動物骨髓細胞染色體畸變，以評價受試物致突變 的可能性。4 定義 染色體型畸變 (Chromosome-type aberr

2、ation) ：染色體結構損傷，表現(xiàn)為在兩個染色單體的 相同位點均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變 (Chromatid-type aberration) ：染色體結構損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染 色單體斷裂重組的損傷。染色體數(shù)目改變 (Numerical-fype aberration) ：哺乳動物細胞正常染色體數(shù)目的改變。5 試驗基本原則 使哺乳動物(如大鼠或小鼠)經(jīng)口或其它適宜途徑染毒，動物處死前用細胞分裂中期阻 斷劑處理，處死后制備骨髓細胞染色體標本，分析染色體畸變。6 試驗方法6.1 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境：選用健康成年大鼠或小鼠，每組每種性別至少 5 只。 實驗動物及實驗動物房

3、應符合國家相應規(guī)定。6.2 受試物6.2.1 受試物配制：固體受試物應溶解或懸浮于適合的溶劑中，并稀釋至一定濃度。液體受 試物可直接使用或予以稀釋。受試物應在使用前新鮮配制，否則就必須證實貯存不影響其穩(wěn) 定性。6.2.2 溶劑的選擇：溶劑在所選用濃度下，不引起毒性效應，不與受試物發(fā)生化學反應。首 選為水溶性溶劑。6.2.3 劑量設置：應進行預試驗以選擇最高劑量。當有毒性時，可以引起死亡或者抑制骨髓 細胞有絲分裂指數(shù)( 50%以上)為指標確定最高劑量。在第一次采集樣品時，需設置3 個可供分析的劑量，在第二次采集樣品時，則僅需設置最高劑量組。如果一次劑量為 2000mg/kg 體重時仍未引起毒性效

4、應，則只設 2000mg/kg 體重劑量組。6.3 對照：在每項試驗中，對每種性別均應設陰性對照組和陽性對照組。除不使用受試物外， 其它處理與受試物組一致。6.3.1 陰性對照：除設溶劑對照(即僅含溶劑)外，如果沒有文獻資料或歷史性資料證實所122 用溶劑不具有有害作用或致突變作用，還應設空白對照組。6.3.2 陽性對照：陽性對照物應能引起染色體結構畸變率明顯高于背景資料。染毒途徑可以 不同于受試物。所選用的陽性對照物最好與受試物類別有關。可以使用下述物質：三亞乙基 密胺( triethylenemelamine )、甲磺酸乙酯( ethyl methanesulphonate)、乙基亞硝基脲

5、( ethyl nitrosonrea)、絲裂霉素 C(mytomycin C )和環(huán)磷酰胺( cyclophosphamide )。6.4 染毒方式：可采用經(jīng)口或其它適宜的染毒方式。一般情況下，染毒 1 次，但分兩次采集 樣品,即每組動物分兩個亞組，亞組 1于染毒后 12h18h處死并采集第一次樣品；亞組 2 于亞 組 1 處死后 24h 采集第二次樣品。如果采用多次染毒，于末次染毒后 12h18h 采集樣品。于 處死動物采集樣品前腹腔注射細胞分裂中期阻斷劑(如用秋水仙素，于處死前4h，按 4mg/kg體重給藥)。6.5 試驗步驟6.5.1 用頸椎脫臼法處死動物，取出股骨，剔除肌肉等組織。6

6、.5.2 剪去股骨兩端，用注射器吸取 5mL 生理鹽水，從股骨一端注入，用 10mL 離心管，從 股骨另一端接取流出的骨髓細胞懸液。6.5.3 將細胞懸液以 1000r/min 的速度離心 5 min 7 min ，去除上清液。6.5.4 加入 0.075mol/L KCl 溶液 7ml ，用滴管將細胞輕輕地混勻，放入37水浴中低滲處理7min ，加入 2mL 固定液(冰醋酸 :甲醇 =1:3)，混勻，以 1000r/min 速度離心 5 min 7min ，棄 去上清液。6.5.5 加入 7mL 固定液，混勻，固定 7min ，以 1000r/min 的速度離心 7min ，棄去上清液。6.

7、5.6 用同法再固定 12 次，棄去上清液。6.5.7 加入數(shù)滴新鮮固定液，混勻。6.5.8 用混懸液滴片，自然干燥。6.5.9 用姬姆薩染液染色。6.6 讀片和結果處理6.6.1 確定有絲分裂指數(shù)： 包括所有處理組、 陽性和陰性對照組 (每只動物計數(shù) 1000 個細胞)。6.6.2 計數(shù)畸變細胞：對每只動物選擇 100 個分散良好的中期分裂相，在顯微鏡油鏡下進行 讀片。在讀片時應記錄每一觀察細胞的染色體數(shù)目，對于畸變細胞還應記錄顯微鏡視野的坐 標位置及畸變類型。所得各組的染色體畸變率用X 2檢驗進行統(tǒng)計學處理，以評價試驗組和對照組之間是否有顯著差異。6.7 結果評價 當受試物引起染色體畸變數(shù)

8、具有統(tǒng)計學意義，并有與劑量相關的增加或者在一個劑量組 出現(xiàn)染色體畸變細胞數(shù)明顯增高，則判定具有致突變性。當結果不能得出，應改變試驗條件 進一步進行測試。在評價時應綜合考慮生物學意義和統(tǒng)計學意義。7 試驗報告報告應包括下列項(1) 受試物名稱、理化性質、所用溶劑及配制；(2) 動物種屬和品系、體重、數(shù)量、性別、來源(注明合格證號和動物級別)；(3) 實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來源、室溫、相對濕度、實驗動物房合格證號；(4) 劑量和組別：選擇劑量的原則、劑量和組別、陰性和陽性對照物及劑量；(5) 試驗條件和方法：染毒途徑和染毒方案、細胞毒性測定方法、所用的細胞分裂中期阻123 斷劑及其劑量和采樣時間、