半枝蓮含藥血清對肝癌H22細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的影響

1、半枝蓮含藥血清對肝癌H22細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位的影響         作者：代志軍, 王西京, 薛茜, 紀(jì)宗正, 劉小旭, 康華峰, 管海濤, 馬小斌, 任宏濤 【摘要】 目的：探討中藥半枝蓮提取物（Scutellaria Barbata extract, ESB）含藥血清對肝癌H22細(xì)胞凋亡率及線粒體膜電位的影響。方法：體外培養(yǎng)小鼠H22肝癌細(xì)胞，以ESB高、中、低劑量含藥           作者：代志軍, 王

2、西京, 薛茜, 紀(jì)宗正, 劉小旭, 康華峰, 管海濤, 馬小斌, 任宏濤【摘要】  目的：探討中藥半枝蓮提取物（Scutellaria Barbata extract, ESB）含藥血清對肝癌H22細(xì)胞凋亡率及線粒體膜電位的影響。方法：體外培養(yǎng)小鼠H22肝癌細(xì)胞，以ESB高、中、低劑量含藥血清培養(yǎng)液作用于H22細(xì)胞，并設(shè)立空白血清及5氟尿嘧啶（fluorouracil，5Fu）組（陽性對照組）。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法檢測藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用；透射電鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化；碘化丙啶標(biāo)記，流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況；采用熒光探針羅丹明123負(fù)載，激光掃描共聚焦顯微

3、鏡下觀察H22細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，分析H22細(xì)胞線粒體膜電位的大小。結(jié)果：ESB含藥血清有一定的抑制H22細(xì)胞增殖的作用，高、中劑量組96 h抑制率分別為（47.5±6.4）%和（36.3±4.5）%。透射電鏡下可見部分細(xì)胞呈典型凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，ESB中、高劑量組有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，其凋亡率分別為（3.15±1.12）%和（7.83±2.25）%，與空白組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）?？瞻讓φ战M、5Fu組和ESB低、中、高劑量，H22細(xì)胞線粒體膜電位分別為（245.45±67.37）、（127.42±

4、;41.35）和（213.68±65.52）、（186.34±56.37）、（142.65±39.44），各組線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=0.826, P<0.01）。結(jié)論：ESB含藥血清可有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低腫瘤細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  半枝蓮 肝癌 細(xì)胞凋亡 線粒體膜電位 藥物血清 體外研究Objective: To investigate the effects of serum containing Scutellaria Barbata extract (ESB) on apoptosis rate

5、 and mitochondrial transmembrane potential (MTP) of liver cancer cell line H22 from mice in vitro.Methods: H22 cells were cultured in vitro and divided into 5 groups: blank control group, lowdose ESB group, mediumdose ESB group, highdose ESB group and fluorouracil (5Fu) group. Methyl thiazolyl tetra

6、zolium assay was utilized to determine the proliferation rates of H22 cells. Cellular morphology was observed under a transmission electron microscope (EM). The rhodamine 123 was used as a fluorescence probe to label the H22 cells, and the fluorescence intensities were observed with a laser scanning

7、 confocal microscope. The fluorescence intensity of H22 cells indicated the MTP of H22 cells.Results: The inhibition of serum containing ESB on the proliferation of H22 cells in vitro was observed in a timedependent manner. The typical morphological changes of apoptosis were observed after incubatio

8、n with ESBcontaining serum in high dose for 48h. The apoptosis rates of blank control group, 5Fu group, lowdose ESB group, mediumdose ESB group and highdose ESB group were (0.51±0.32)%, (11.26±2.97)%, (1.07±0.46)%, (3.15±1.12)%, (7.83±2.25)% respectively. ESB could reduce th

9、e MTP of H22 cells from mice as compared with the untreated group. The MTPs of the blank control group, 5Fu group, and low, medium and highdose ESB groups were (245.45±67.37), (127.42±41.35), (213.68±65.52), (186.34±56.37) and (142.65±39.44) respectively, which were negative

10、ly correlated with the apoptosis rates.Conclusion: ESBcontaining serum effectively induces apoptosis, which may be related to the decrease of MTP in H22 cells.Keywords: Scutellaria barbata; liver cancer; apoptosis; mitochondrial transmembrane potential; drugcontaining serum; in vitro半枝蓮為唇形科黃芩屬植物（Scu

11、tellaria barbata D. Don）的干燥全草，性辛、苦、寒，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛等功效。文獻(xiàn)報(bào)道，半枝蓮可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長13，而且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，線粒體與細(xì)胞凋亡進(jìn)程密切相關(guān)，在藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，線粒體在促進(jìn)凋亡信號和caspase激活之間起著不可替代的作用4。本實(shí)驗(yàn)通過觀察半枝蓮提取物（Scutellaria barbata extract, ESB）誘導(dǎo)H22小鼠肝癌細(xì)胞凋亡過程中線粒體膜電位(mitochondrial transmembrane potential, MTP)變化，探討其

12、可能的作用機(jī)制。1  材料和方法1.1  動(dòng)物和瘤株  清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量220250 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(陜醫(yī)動(dòng)字第08005號）。小鼠肝癌H22細(xì)胞株由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保存。1.2  藥品和試劑  新生牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco, USA）；碘化丙啶（propidium iodide, PI）、四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）和熒光探針羅丹明123（Sigma, USA）；ESB（為101的水提物），批號為07078（西安中鑫生物科技

13、有限公司）；5氟尿嘧啶（5fluorouracil injection, 5Fu）注射液，250 mg/支，批號為070201（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。流式細(xì)胞儀（Becon Dickinson Facsalibur公司, USA），激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus, FluoViewTM FV300, Japan）。1.3  藥物血清制備  雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為空白對照組和ESB低、中、高劑量組，每組5只。ESB高、中、低劑量組分別給予ESB 6、3、1.5 g/(kg·d)灌胃（稱取相應(yīng)質(zhì)量ESB加入10 ml蒸餾水中制

14、成混懸液），2次/d，共3 d；空白對照組給予灌服生理鹽水。灌藥前禁食4 h，自由取水。于末次灌胃后2 h心臟采血，室溫下靜置4 h，2 400 r/min離心10 min，分離血清，0.22 m微孔濾膜無菌過濾后置20 冰箱保存?zhèn)溆谩?.4  細(xì)胞培養(yǎng)  肝癌H22細(xì)胞在含10%小牛血清、1×104 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，于37 和5% CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)過消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.5  MTT法檢測H22細(xì)胞增殖率  選取對數(shù)生長期的H22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5&#

15、215;104/ml，加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 l。將培養(yǎng)板放入37 、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁12 h后取出培養(yǎng)板，ESB各組分別加入相應(yīng)的10%藥物血清，同時(shí)設(shè)置空白對照組、5Fu對照組和調(diào)零孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72和96 h后終止反應(yīng)，每孔加入10 l（5 g/l）MTT，孵育4 h。吸出上清液，加入200 l二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）。在平板搖床振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處每孔的吸光度（absorbance, A），計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率（inhibition ratio,

16、IR）=（對照組A值處理組A值）/對照組A值×100%。1.6  透射電鏡下觀察H22細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)  取空白對照組、5Fu對照組和ESB高劑量組H22細(xì)胞，藥物作用48 h后，收集細(xì)胞，常規(guī)固定染色，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。1.7  流式細(xì)胞儀檢測H22細(xì)胞周期和凋亡率  取各組處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，常規(guī)消化，制成單細(xì)胞懸液。加入離心管中，800 r/min離心5 min，棄掉離心管中上清；以冰PBS緩沖液漂洗2遍，沿管壁緩慢加入75%的冰乙醇固定，4 過夜；測試前用PBS液洗去乙醇，離心除去上清，每管加入100 g/ml RNA酶1 ml

17、，置于37 孵箱中30 min；然后每管中加入125 g/ml PI 1 ml標(biāo)記，低溫（28 ）避光靜置30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡率。1.8  激光掃描共聚焦顯微鏡檢測H22細(xì)胞線粒體膜電位  將各組細(xì)胞以1×106個(gè)/ml重懸于培養(yǎng)基中。各吸取1 ml移入提前標(biāo)記好的試管中；于每管中加入羅丹明123染液10 l（終濃度1 l/ml）；于37 、5 CO2培養(yǎng)箱中避光孵育20 min；離心后以培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次；重懸細(xì)胞于培養(yǎng)基中，孵育60 min；吸取100 l上述混合液滴加于載玻片上。將玻片固定于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，在熒光顯微鏡下初調(diào)

18、焦平面，觀察細(xì)胞狀態(tài)及負(fù)載情況。以細(xì)胞內(nèi)羅丹明123熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity, FI）表示線粒體膜電位5。每組取3個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野，取其均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示。應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析的組間比較法，相關(guān)性分析采用Spearman法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為=0.05。2  結(jié)果2.1  ESB含藥血清對H22細(xì)胞增殖的影響  高、中劑量ESB有一定的抑制H22細(xì)胞增殖的作用，低劑量ESB對H22細(xì)胞抑制作用不明顯。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高、中劑量ESB含藥血清對H22細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)明顯的時(shí)效關(guān)系。高、中劑量組96 h抑制率分別為（47.5±6.4）%和（36.3±4.5）%。見圖1。2.2  ESB含藥血清對H22