加氧低溫灌流下31磷-磁共振頻譜與肝酶測定在判斷大鼠供肝活力中的意義

1、    加氧低溫灌流下31磷-磁共振頻譜與肝酶測定 在判斷大鼠供肝活力中的意義        【摘要】目的探討判斷經受熱缺血的肝臟活力的方法。方法將18只SD大鼠隨機分成3組：A組肝臟熱缺血時間（WI）為0min；B組WI為30min；C組WI為60min。各組肝臟冷保存后22.5h，采用31磷-磁共振頻譜（31P-MRS）測定各組加氧低溫灌流30min時的離體肝臟頻譜，同時測定保存液和灌流液中肝酶的變化。結果-三磷酸核酸（-NTP）與亞甲基二磷酸（MDP）的比值，

2、B組與A組比較， P>0.05；C組與A、B組比較，P<0.01。肝酶測定結果：隨著熱缺血時間的延長，保存液中的肝酶逐漸升高，每組之間比較，差異均有顯著性(P<0.05)；灌流液中的肝酶，A組與B組比較，差異無顯著性(P>0.05)，C組與A、B兩組比較，差異均有極顯著性（P<0.01）。結論測定加氧低溫灌流下大鼠離體肝臟的ATP再生能力能較好判斷其活力，該方法在臨床熱缺血供肝活力的判斷上具有一定參考價值；同時測定保存液和灌流液中的肝酶含量，能配合31P-MRS判斷肝臟的活力?！娟P鍵詞】肝臟；核磁共振；酶類；創(chuàng)傷與損傷 Assessment of the viab

3、ility of the rat liver after warm ischemic injury via 31P-MRS of the rat liver or determination of hepatic enzymes during oxygenated hypothermic reperfusionCAI Shouwang?, GU Wanqing, FENG Yuquan（Department of Hepatobiliary Surgery of PLA, Beijing, 100853 China）【Abstract】ObjectiveTo investigate the a

4、ssessment of the viability of the donor liver after warm ischemic injury. Methods18 SD rats were randomly and equally divided into 3 groups: A, B, C. Six rat livers were subjected to the warm ischemia 0, 30 and 60 min in groups A, B and C respectively. Before reperfusion all isolated livers were sto

5、red in modified Krebs-Hensleit (mK-H) solution at 0 to 4 for 2 to 2.5h. Subsequently, the livers were perfused through portal vein with oxygenated cold mK-H solution for 30 to 40 min in a 31P-MRS machine while the 31P-MRS spectroscopies were carried out. The changes in liver enzymes in stored soluti

6、on and perfused fluid were determined. ResultsThe ability of ATP regeneration of rat livers in the group B was similar to group A (P>0.05). However, in the group C, 3 of 6 rat livers could not resuscitate this ability, and the average level of ATP regeneration of group C was 32.6% of the group A,

7、 which was significantly less than that in the group A and group B（P<0.01）. With the warm ischemia prolonged，the hepatic enzymes including ALT, AST and LDH were increased gradually in stored solution with the difference being significant among the three groups (P<0.01). There was significant d

8、ifference in hepatic enzymes between group C and group A or group B (P<0.01). ConclusionsMeasurement of ability of ATP regeneration of isolated rat liver after warm ischemia could be used to assess the viability of the warm ischemic livers in clinical practice. Determination of the levels of hepa

9、tic enzymes in the stored solution and the perfused solution could evaluate the hepatic viability cooperating with 31P-MRS. 【Key words】Liver；Nuclear magnetic resonance；Enzymes；Wounds and injuries由于供肝常受到熱缺血損傷，因此，迫切需要建立一套精確判斷供肝活力的方法。檢測供肝活力的方法很多，如肝活檢、肝功能生化檢查、動脈酮體比、利多卡因試驗、供肝三磷酸腺苷（ATP）含量測定等，由于受到不同客觀因素的影響

10、，上述方法的實用價值存在爭議1。一般認為肝移植后的ATP再生能力與移植物的早期存活存在相關性2，3。我們采用31磷-磁共振頻譜（31P-MRS）測定離體肝臟ATP再生能力，并測定保存液和灌洗液中的肝酶含量，以探討其在判斷經受熱缺血的肝臟活力中的意義。材料與方法一、材料SD大鼠18只（解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重170220g。將大鼠隨機分成3組，每組6只：A組熱缺血時間（WI）0min；B組WI為30min；C組WI為60min。保存液和灌流液均采用改良的Krebs-Hensleit液（K-H液，解放軍總醫(yī)院制劑室配制），配方為：NaCl 118mmol/L，KCl 4.70

11、mmol/L，CaCl2 2.25mmol/L，MgSO4 1.18mmol/L，KH2PO4 0.118mmol/L，NaHCO3 24.9mmol/L，葡萄糖11.1mmol/L。采用核磁共振儀測定頻譜。二、實驗方法實驗大鼠以質量分數為20%烏拉坦腹腔注射麻醉（1 400mg/kg）。從腎靜脈開口下方的腔靜脈注入含肝素100U/ml的乳酸林格液2ml作全身肝素化，結扎脾靜脈，從腸系膜上靜脈插入18G導管針至門靜脈，予雙重結扎、固定，同時迅速結扎肝動脈。A組大鼠在完成肝門阻斷后迅速剪斷肝下下腔靜脈，并從門靜脈注入04乳酸林格液50ml灌洗肝臟，迅速剪斷肝上下腔靜脈、腸系膜上靜脈、脾靜脈和肝動

12、脈。將離體肝臟浸泡在04改良K-H液60ml中冷保存22.5h。B組和C組大鼠在阻斷肝血流后分別按分組要求臨時關腹30和60min，使肝臟承受熱缺血30和60min，其余步驟與A組相同。將待灌流的離體肝臟放入外徑為25mm的測試管中，使其懸浮并固定在裝有04改良K-H液的測試管的下段。與肝臟平行的位置貼管壁放一含10mol/L亞甲基二磷酸（MDP）外標毛細管，線圈的溫度控制在（9±1）。保持灌流液液面距肝臟的高度為20cm。實驗過程中持續(xù)向灌流液內灌以含95%O2和5%CO2的混合氣體（1L/min），氧飽合后的灌流液pH為7.35(8)。灌流液流入肝臟時的溫度控制在（8±

13、0.5），灌流速度為（12±2）ml/min。測定每個肝臟持續(xù)灌流30min的頻譜。核磁共振（NMR）頻譜測定條件：采用日本JEOL GX-400 NMR頻譜儀，立式窄孔（孔徑54mm）磁體，磁場強度9.4T（特斯拉）。25mm標準磷探頭，共振頻率為161.83MHz。采用4k數據點，譜寬設10kHz。不鎖場，調勻場至水的質子（1H）信號半峰寬達70100Hz。單脈沖序列非去偶方式測定，脈沖傾角45°，脈沖寬度55s，采樣時間0.41s，脈沖間隔0.5s，每個譜為掃描256次所得的信號累加。傅立葉變換前加指數窗函數，采用40Hz線的增寬因子以提高信噪比。取每只大鼠肝臟的保存

14、液標本1ml及灌流液（前30min）1ml，放入-40 冰箱保存、集中，采用日立7150全自動生化分析儀測定保存液、灌流液內的丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）含量。三、統(tǒng)計學處理所得數據以均數±標準差表示，采用方差分析檢驗。結果一、含氧改良K-H液灌流A、B、C三組大鼠肝臟的頻譜結果1為A組1只大鼠肝臟冷保存2.5h后灌流30min所得的頻譜，典型31P-MRS含有6個譜峰：磷酸單酯（PME）、磷酸二酯（PDE）、無機磷酸鹽（Pi）和3個三磷酸核苷（、-NTP）。由于-三磷酸核酸（-NTP）信號幾乎完全來自于ATP，因此常將其作為ATP的一個內在

15、量化標準3。0min時各組均測不到-NTP信號，隨著灌流的開始，-NTP出現并逐漸上升。表1為各組各個時間點-NTP與外標MDP的比值，A組灌流各個時間點-NTP峰值均高于B組、C組。灌流30min時，A組-NTP/MDP較B組高8.5%，但差異無顯著性（P>0.05）。灌流10min和20min，A、B兩組-NTP/MDP相比，差異亦無顯著性（P>0.05）。C組有3個肝臟的-NTP不能檢出，另3個雖能檢出，但峰值亦明顯偏低（灌流30min時-NTP/MDP約為A組的65.2%）。灌流10、20、30min等各個時間點的-NTP/MDP值，A、B兩組均明顯高于C組，差異有極顯著性

16、（P<0.01）。     表13個組灌流各時間點-NTP與MDP的比值組別n灌流不同時間點的-NTP/MDP值0min10min20min30minA組600.285±0.0340.352±0.0790.423±0.059B組600.275±0.0330.338±0.0600.387±0.065C組600.102±0.1130.127±0.1450.138±0.156     二、保存液及灌流液中肝酶的測定結果保存液及

17、灌流液中ALT、AST及LDH的含量見表2。3種肝酶中以LDH升高最為明顯，C組灌流液中的LDH分別為A、B二組的85倍和37倍；C組可以測到-NTP信號的灌流液（3只）中的LDH平均值為168.3×10-2mol.s-1.L-1，測不到-NTP信號的另3只灌流液中的LDH平均值為398.5mol.s-1.L-1，為前者的2.4倍。 表2保存液與灌流液中的肝酶含量（mol.s-1.L-1）組別nALTASTLDH保存液灌流液保存液灌流液保存液灌流液A組 63.2±1.5*3.8±1.26.8±3.2*7.2±3.318.7±5.3*3

18、.3±2.8B組622.2±9.2*7.0±3.8*46.4±15.4*9.7±6.0*154.0±103.2.7.7±3.2*C組650.8±40.2*44.6±28.680.2±31.7*45.1±8.0440.7±228.6*283.4±169.0     注：.各組間比較，P<0.05；.與A組比較，P>0.05；與A、B組比較，P<0.01 討論器官離體后氧和各種代謝底物終止供應，氧化磷酸化作用減弱

19、，ATP二磷酸腺苷（ADP）一磷酸腺苷（AMP）次黃嘌呤黃嘌呤尿酸依次降解，ATP的含量迅速降低，37 時肝臟缺血5min，或者冷保存130min，31P-MRS即不能檢測到-NTP4。當血液和能量代謝底物供應恢復時，即使在低溫情況下，有活力的器官能很快利用AMP、嘌呤合成ATP5。因此，許多學者認為動態(tài)觀察ATP再生能力是判斷器官活力的最有效的指標2，6，7。我們觀察到，冷保存后2h，即難以測到-NTP，說明灌流前不可能通過測定-NTP絕對水平來判斷供肝的活力。灌流開始后，A、B兩組灌流10min時即能測到-NTP，而且兩組各個時間點的-NTP/MDP相比，差異均無顯著性，說明其承受的30m

20、in熱缺血損傷是可逆的，而C組有3個肝臟灌流后仍測不到-NTP信號，說明其已喪失活力，另3個的-NTP峰值亦明顯偏低，與A組比較，這3個肝臟的活力亦明顯受損。肝臟承受冷、熱缺血到一定程度時，肝細胞胞漿會出現空泡變，空泡變胞漿膜破裂釋放各種肝酶，引起肝細胞不可逆損傷5,8。因此，肝酶，特別是LDH能較好地反映肝臟受損程度及活力9。我們的實驗觀察到，隨著熱缺血時間的延長，肝臟保存液和灌流液中的肝酶依次升高（表2），其中以LDH升幅最為明顯。同時，我們還發(fā)現，與保存液不同，灌流液中的肝酶，A、B兩組之間的差異無顯著性，且明顯低于C組（P<0.01），這一結果與31P-MRS所測得各組ATP再生

21、能力的結果是一致的，說明灌流液中肝酶的含量較之保存液能更好地反映肝臟的活力。加氧低溫灌流與常溫下的再灌注不同，一般不會出現氧誘導的組織損傷4，5，8，但這方面的問題仍有待進一步研究。作者單位：蔡守旺（100853北京，解放軍總醫(yī)院肝膽外科）顧萬清（100853北京，解放軍總醫(yī)院肝膽外科）馮玉泉（100853北京，解放軍總醫(yī)院肝膽外科）劉永雄（100853北京，解放軍總醫(yī)院肝膽外科）田建廣（軍事醫(yī)學科學院國家生物醫(yī)學分析中心）陳金明（內蒙赤峰市醫(yī)院）參考文獻1，Jan Pruim，Ids JK，Elizabeth BH，et al. Selection criteria for liver do

22、nation: a review. Transplant Int，1993，6:226-235.2，Kamiike W, Burdelski M, Steinhoff G, et al. Adenine nucleotide metabolism and its relation to organ viability in human liver transplantation. Transplantation，1988, 45:138-143.3，Reckendorfer H, Burgmann H. Spieckermann PG hepatic energy metabolism dur

23、ing hypothermic storage and after reperfusion. Evaluation of the University of Wisconsin and the Bretschneider solutions. Transplant Proc，1991, 23:1974-1975.4，Henze E，Lietzenmayer R, Kunz G，et al. Prerequisites and initial experience for the noninvasive routine evaluation of viability of experimental and human organ transplants by magnetic resona