人突變型低氧誘導(dǎo)因子1α腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

1、    人突變型低氧誘導(dǎo)因子1腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定            作者：時(shí)間：2007-11-22 11:25:00                           

2、     作者：郭壽貴，吳平生，王月剛，傅銳斌【關(guān)鍵詞】  腺病毒    Construction and identification of human mutant hypoxia inducible factor1 adenovirus vector【Abstract】 AIM: To construct adenovirus vector containing the mutant HIF1 gene and to study the effect of mutant hypoxia inducible f

3、actor1 on the angiogenesis of coronary heart disease. METHODS:  Human mutant HIF1 cDNA obtained from the plasmid pcDNA3.1(+)HIF1 was cloned into plasmid pShuttle2. The expression cassette containing mutant HIF1 cDNA was obtained from the recombinant pShuttle2 with double digestion of PISce I an

4、d ICeu I and then ligated to AdenoX Viral DNA with in vitro ligation. The recombinant adenoviral plasmid was identified and transfected into the adenoviral packaging cell HEK293 by lipofectamine2000 mediated gene transfer method to pack the virus. The recombinant adenovius was confirmed by polymeras

5、e chain reaction (PCR) and the titer was determined. RESULTS:  The recombinant pAdenoHIF1 was correctly constructed and confirmed by restriction endonuclease analysis and DNA sequencing analysis. The transfected HEK293 cells were lysed by freezethawing to obtain the recombinant adenovirus in th

6、e lysate. The PCR product of the lysate confirmed the presence of recombinant adenovirus. The viral titer was 2×1012 p/L. CONCLUSION:  The recombinant adenovirus containing the mutant HIF1 gene has been successfully constructed, which paves the way for mutant HIF1 gene therapy of coronary

7、heart disease.【Keywords】 hypoxia inducible factor1; mutant; adenovirus vector; gene therapy【摘要】 目的: 構(gòu)建人突變型低氧誘導(dǎo)因子1(HIF1)腺病毒表達(dá)載體，研究人突變型HIF1基因?qū)谛牟〉难苄律饔? 方法: 采用分子克隆技術(shù)，由pcDNA3.1(+)HIF1（突變型）質(zhì)粒獲得突變型HIF1 cDNA，克隆到穿梭質(zhì)粒pShuttle2，以PISce I和ICeu I雙酶切重組穿梭質(zhì)粒，獲得含有突變型HIF1 cDNA的表達(dá)盒，通過體外連接法與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒AdenoX Viral DN

8、A連接，重組成pAdenoHIF1腺病毒質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后，在HEK293細(xì)胞中包裝成為重組AdenoHIF1腺病毒，并進(jìn)行PCR鑒定及滴度測(cè)定. 結(jié)果: 經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序證實(shí)重組腺病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，包裝后凍融細(xì)胞的上清PCR檢測(cè)重組腺病毒包裝成功,病毒滴度為2×1012 pfu/L. 結(jié)論: 成功構(gòu)建重組腺病毒AdenoHIF1（突變型），為冠心病的突變型HIF1基因治療研究奠定基礎(chǔ).【關(guān)鍵詞】 低氧誘導(dǎo)因子1; 突變; 腺病毒; 基因治療0引言低氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxiainducible factor 1,HIF1)是一種在體內(nèi)廣泛存在的由低氧、鈷等誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)

9、生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，由和亞基組成，在低氧應(yīng)答反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用，它能與靶基因的缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）結(jié)合調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)血管新生等起極其關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用. HIF1受低氧誘導(dǎo)，決定HIF1的活性，然而常氧狀態(tài)下，其氧依賴降解區(qū)（oxygen dependent degradation domain,ODDD）內(nèi)564位脯氨酸殘基Pro564發(fā)生羥基化，迅速被降解. 為此我們?cè)谝讯c(diǎn)突變其Pro564為丙氨酸（Ala）基礎(chǔ)上，構(gòu)建重組

10、人突變型HIF1腺病毒載體，以進(jìn)一步研究常氧條件下該突變型基因表達(dá)及對(duì)冠心病的血管新生作用.1材料和方法1.1材料1.1.1試劑、試劑盒各種限制性內(nèi)切酶Pac，PISce I，ICeu I等及T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、XGal分別購(gòu)自Takara，NEB等公司；DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(PAA)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)，超純質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen）.1.1.2質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞系等AdenoXTM Adenoviral Expression Systems(BD.Clontech):包括有pShuttle2, pS

11、huttle2laZ, AdenoXTM Viral DNA等，重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）HIF1(突變型)(本室構(gòu)建)，大腸桿菌DH5（本室保存），HEK293細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所）.1.1.3引物HIF1cDNA片段引物（由博亞公司設(shè)計(jì)并合成），上游引物：5GACACAGAAGCAAAGAACCC3，下游引物：5TCAAAGCGACAGATAACACG3，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)460 bp. BD.Clontech所提供引物（兩個(gè)引物分別與穿梭質(zhì)粒表達(dá)盒及骨架質(zhì)粒的部分序列結(jié)合），上游引物：5TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC3，下游引物：5AGATCTGAGCTTTCGC

12、TACC3，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)287 bp.1.2方法1.2.1重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建以Nhe，Apa雙酶切pcDNA3.1（+）HIF1（突變型，下同）及pShuttle2，膠回收突變型HIF1片段及pShuttle2線性化大片段，連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5，于卡那霉素抗性LB平板上篩選單菌落擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，行酶切及PCR鑒定.1.2.2酶切連接法重組腺病毒骨架質(zhì)粒以PISce I，ICeu I雙酶切pShuttle2HIF1，膠回收含HIF1的表達(dá)盒片段，與線性化的腺病毒骨架質(zhì)粒AdenoXTM Viral DNA作連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5，氨芐抗性LB平板篩選，挑1216個(gè)單菌落擴(kuò)增并作菌液PCR鑒定

13、，提取重組腺病毒質(zhì)粒pAdenoHIF1，予Xho酶切鑒定；以 PISce I，ICeu I雙酶切pShuttle2laZ，膠回收含laZ基因的表達(dá)盒片段，與AdenoXTM Viral DNA作連接，方法基本同上，但菌落篩選時(shí)每個(gè)平皿涂IPTG 100 L及XGal 20 L，挑出藍(lán)色菌落，重組質(zhì)粒稱pAdenolaZ.1.2.3重組腺病毒包裝以含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一日細(xì)胞傳代，細(xì)胞數(shù)(0.51)×106/（60 mm平皿），轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率在70%左右；重組腺病毒質(zhì)粒pAdenoHIF1約45 g以Pac線性化，純化后50 L滅菌三蒸水

14、重溶，以Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，約10 d左右大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）后收集細(xì)胞，重懸于PBS 500 L，-7037反復(fù)凍融3次，離心收集上清，此稱為病毒原液，-20保存. 同法以pAdenolaZ轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞作對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后固定細(xì)胞，作原位XGal染色，觀察轉(zhuǎn)染效率.1.2.4病毒擴(kuò)增、滴度測(cè)定及鑒定取上述細(xì)胞裂解液250 L重新感染在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，如上待大部分細(xì)胞CPE完全形成后，收集細(xì)胞，PBS重懸，凍融細(xì)胞，離心收集上清凍存；采用CPE法（EndPoint Dilution Assay）測(cè)定病毒滴度

15、，重組病毒稱AdenoHIF1. 取2 L病毒原液，行PCR鑒定.2結(jié)果2.1重組穿梭質(zhì)粒pShuttle2HIF1的鑒定目的基因自pcDNA3.1（+）HIF1酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle2連接成功，Nhe及Apa單、雙酶切鑒定，Apa單酶切片段大小約6500 bp,雙酶切兩個(gè)片段大小分別為4000 bp，2500 bp左右（Fig 1），酶切鑒定正確；以HIF1的一對(duì)引物行PCR鑒定，擴(kuò)增出一約460 bp的DNA（Fig 2），與預(yù)期值一致，測(cè)序后與GenBank的HIF1cDNA序列比對(duì)顯示564位脯氨酸密碼子CCC突變?yōu)楸彼崦艽a子GCC（下劃線處）. 2.2重組腺

16、病毒載體pAdenoHIF1鑒定提取重組腺病毒質(zhì)粒pAdenoHIF1以Xho酶切（Fig 3），酶切片段有14 500，8046，4300和2465 bp，符合預(yù)期，鑒定正確，以BD Clontech公司所提供的引物行PCR鑒定，擴(kuò)增出287 bp的DNA片段(Fig 4)，與預(yù)期值一致.2.3重組腺病毒載體pA    denolaZ轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后XGal原位染色結(jié)果pAdenolaZ轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后XGal原位染色，顯示近20%左右的轉(zhuǎn)染細(xì)胞染成藍(lán)色(Fig 5).2.4重組腺病毒AdenoHIF1的鑒定及滴度測(cè)定重組腺病毒AdenoHIF1以BD

17、 Clontech公司所提供的引物行PCR鑒定，結(jié)果同F(xiàn)ig 4，成功擴(kuò)增出287 bp的目的條帶，說明重組病毒成功. 測(cè)病毒原液滴度為3×1010 p/L，擴(kuò)增后的病毒滴度為2×1012 p/L.3討論腺病毒具感染譜廣，高病毒滴度及感染效率，不引起插入突變等優(yōu)點(diǎn)，是常用的基因轉(zhuǎn)移載體之一. 我們采用的腺病毒載體是E1/E3區(qū)同時(shí)去除的復(fù)制缺陷型，缺失E1區(qū)的腺病毒不具復(fù)制能力. 采用體外連接的重組方法，首先將目的基因連接到穿梭載體pShuttle2的h啟動(dòng)子和40多聚腺苷酸尾之間，通過酶切獲得含目的基因的表達(dá)盒片斷，直接與線性化的病毒骨架質(zhì)粒連接，然后在能反式提供E1基因

18、產(chǎn)物的293細(xì)胞中包裝出具有復(fù)制能力的重組腺病毒. 此種構(gòu)建方法比常用的細(xì)菌內(nèi)同源重組法，具有高效、快速的優(yōu)點(diǎn). 大量擴(kuò)增重組病毒后行氯化銫梯度超速離心得到高純度和滴度的重組腺病毒，可用于體內(nèi)試驗(yàn).促血管新生因子研究較多的有VEGF，F(xiàn)GF等，已有期臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶VEGF，F(xiàn)GF等基因的腺病毒載體可促進(jìn)治療性血管新生而改善缺血性心臟病患者的臨床癥狀1-3. 然而VEGF治療可導(dǎo)致新生血管不成熟、組織水腫、血管滲漏，甚至可能促進(jìn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展、血管瘤形成及側(cè)支循環(huán)的減少，F(xiàn)GF則與蛋白尿有關(guān)4,5. 近年發(fā)現(xiàn)，HIF1可誘導(dǎo)生理功能完整的血管新生，其通過與靶基因HRE結(jié)合調(diào)控下游超過50種基因的

19、轉(zhuǎn)錄，包括VEGF及其受體等多種促血管生長(zhǎng)、發(fā)育的基因. 目前在冠心病等涉及治療性血管新生的疾病研究中，HIF1被認(rèn)為是最具有臨床治療前景的基因之一6,7. 臨床前期研究表明其可促進(jìn)缺血側(cè)支血管的灌注、促進(jìn)血管新生，在模擬的缺血再灌注損傷中對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞具保護(hù)作用8,9. 然而常氧狀態(tài)下HIF1容易降解，其 ODD區(qū)的Pro564在脯氨酰羥化酶作用下羥基化成羥脯氨酸殘基，介導(dǎo)ODD區(qū)與E3泛素連接酶復(fù)合體組分von HippelLindau 腫瘤抑制蛋白(pVHL)相結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)HIF1經(jīng)泛素蛋白酶體途徑降解；低氧狀態(tài)下脯氨酰羥化酶活性受到抑制，Pro564羥基化反應(yīng)受阻，導(dǎo)致HIF1降解

20、途徑中斷，細(xì)胞內(nèi)HIF1水平增加10,11. 通過對(duì)Pro564的定點(diǎn)突變，使得pVHL不能與HIF1 ODD區(qū)穩(wěn)定結(jié)合，常氧下HIF1可得到穩(wěn)定表達(dá). 我們?cè)跇I(yè)已完成定點(diǎn)突變Pro564為Ala564基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建人突變型HIF1重組腺病毒載體，解決了常氧下HIF1基因表達(dá)困難的問題，為其體內(nèi)外研究開辟了新途徑，為進(jìn)一步研究其對(duì)冠心病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Hedman M, Hartikainen J, Syvanne M, et al. Safety and feasibility of catheterbased local intracoronar

21、y vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplasty and instent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia: Phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial (KAT)J. Circulation, 2003;107(21):2677-2683.2 Lederman RJ, Mendelsohn FO, Anderson RD,

22、 et al. Therapeutic angiogenesis with recombinant fibroblast growth factor2 for intermittent claudication (the TRAFFIC study): A randomised trialJ. Lancet, 2002; 359 (9323):2053-2058.3 Grines CL, Watkins MW, Helmer G, et al. Angiogenic gene therapy (AGENT) trial in patients with stable angina pector

23、isJ. Circulation, 2002;105(11): 1291-1297.4  Lee RJ, Springer ML. VEGF gene delivery to myocardium: Deleterious effects of unregulated expressionJ. Circulation, 2000;102(8): 898-901.5  Fam NP, Verma S, Kutryk M, et al. Clinician guide to angiogenesisJ. Circulation, 2003; 108(21):2613-2618.6  Tarzami ST, Singh JP. Pharmacological revascularisation in coronary and peripheral vascular diseaseJ. Expert Opin Investig Drugs, 2004;13(10):1319-1326.7  Giaccia A, Siim BG, Johnson RS. HIF1 as a target for drug developmentJ. Nat Rev Drug D