人胎盤組織源造血干祖細(xì)胞的初步研究(1)

1、    人胎盤組織源造血干/祖細(xì)胞的初步研究(1)    】 為了探討足月胎盤組織源單個(gè)核細(xì)胞(human mature placenta tissue-derived mononuclear cells，hPTMNC)中CD34 細(xì)胞的體外增殖、分化能力，尋找新的造血干/祖細(xì)胞來源供臨床應(yīng)用，分別采用流式細(xì)胞術(shù)檢測、造血干/祖細(xì)胞集落培養(yǎng)和體外無細(xì)胞因子長期培養(yǎng)的方法，測定胎盤組織源和臍血中的CD34 細(xì)胞及其亞群和集落形成單位的數(shù)量。結(jié)果表明：胎盤組織源CD34 細(xì)胞（2.74±0.61%）及其亞群C

2、D34 / CD38-細(xì)胞（2.46±0.42%）、造血干/祖細(xì)胞集落CFU-GM（186.90±24.52）和BFU-E（101.40±13.35）水平都較臍血CD34 細(xì)胞（1.73±032%）、CD34 /CD38-細(xì)胞（0.80±0.25%）、CFU-GM（136.90±25.15）、BFU-E(49.20±8.13)高；前者在體外無細(xì)胞因子培養(yǎng)條件下存活時(shí)間長，且細(xì)胞數(shù)量增加約2倍。結(jié)論：胎盤是胎兒期的造血器官，胎盤細(xì)胞成分更幼稚，是一種造血干/祖細(xì)胞移植的新的種子細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】 胎盤組織Preliminary

3、 Study on Human Mature Placenta Tissue-derived Hematopoietic Stem/Progenitor CellsAbstract    Clinical transplantation has indicated that cord blood (CB) can be used in the hematopoietic reconstitution in the children，but not well used in the adult patients because of the low cel

4、l amount. The present study aimed to explore the capability of proliferation and differentiation of the hematopoietic stem /progenitor cells derived from human mature placenta tissue (PT) in vitro，and to find a new source of hematopoietic/progenitor cells for clinical transplantation. CD34 cells in

5、human mature placenta tissue were isolated and characterized by using enzyme-digestion method and flow cytometry. A long culture system without cytokines was established with human mature placenta tissue-derived mononucleated cells and cord blood mononuclear cells. The number of nucleated cells was

6、weekly counted in culture for 14 weeks. The number of CFC was counted in culture for 2 weeks. The results showed that the CFC yields（CFU-GM，186.90±24.52；BFU-E，101.40±13.35）and the percentage of CD34 cells (2.74±0.61%) and CD34 /CD38- cells (2.46±0.42%) in placenta tissue (PT) wer

7、e higher than CFC（CFU-GM，136.90±25.15；BFU-E，49.20±8.13），CD34 cells (1.73±0.32%) and CD34 /CD38- cells (0.80±0.25%) in cord blood (CB). The MNCs from PT have shown more survival ability than the cells from CB in the long-term cell culture condition；and the cells from PT increased

8、by 2 times. It is concluded that the placenta may be another hematopoietic organ in ontogeny. The cells from placenta were more juvenile，and may be favorable source for clinical stem cell transplantation.Key words placenta tissue；cord blood；CD34 cell；hematopoietic    stem cell tr

9、ansplantation    胎盤中含有大量的造血干細(xì)胞已被證實(shí)，臍血中的大量與造血相關(guān)的因子經(jīng)研究證實(shí)來自胎盤1，2，這些造血相關(guān)因子可以有效地對(duì)臍血造血干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和提高臍血造血干細(xì)胞的植入能力。這些研究結(jié)果說明，胎盤是造血干/祖細(xì)胞的適宜的生存環(huán)境。研究證明，小鼠胎盤參與了胚胎期的造血3，基于此我們對(duì)足月胎盤的造血干細(xì)胞的數(shù)量和功能進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。材料和方法標(biāo)本收集10份胎盤與其對(duì)應(yīng)的臍血。臍血 足月妊娠胎兒娩出后立即將臍帶結(jié)扎，對(duì)其消毒后穿刺臍靜脈，收集于加了抗凝劑的采血袋中，在24小時(shí)內(nèi)完成細(xì)胞分離。胎盤 收集完臍血后，盡量保持胎盤的無菌

10、狀態(tài)，切割胎盤的胎兒面組織成0.5-1mm3大小組織塊，用無菌的敷料包裹。8小時(shí)內(nèi)進(jìn)行酶消化以收集細(xì)胞。細(xì)胞因子和抗體重組人干細(xì)胞因子(rhSCF)、重組人粒-巨細(xì)胞集落因子(rhGM-CSF)、重組人白細(xì)胞介素3(rhIL-3)均為美國Immunex公司產(chǎn)品?？笴D34、CD38單克隆抗體為Peprotech公司產(chǎn)品；EPO購自Chemicon公司。主試劑牛血清白蛋白(BSA)、甲基纖維素、胰酶、EDTA、DMED、胎牛血清均購自美國Sigma公司。單個(gè)核細(xì)胞的制備臍血細(xì)胞（CBC） 臍血標(biāo)本中加入等量的PBS液稀釋后緩慢地加入到淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll-Hypague，比重1.077；

11、臍血分離液為21)面上，常溫條件下1 000×g離心30分鐘，吸取中間層單個(gè)核細(xì)胞(MNC)；用PBS液稀釋為106/ml。胎盤組織源細(xì)胞（PTC） 無菌條件下剪切胎盤胎兒面組織成0.5-1mm3的組織塊，用消化液（025%胰酶 0.02% EDTA）37消化30分鐘，用100目的細(xì)胞篩過濾，用PBS液洗滌并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1012/ml；淋巴細(xì)胞分離液分離并吸取中間層單個(gè)核細(xì)胞，用PBS液稀釋細(xì)胞濃度為106/ml。長期培養(yǎng)在DMEM中加入30%的臍帶混合血漿，10%胎牛血清和1%抗生素制備成細(xì)胞培養(yǎng)液。用該培養(yǎng)液調(diào)整單個(gè)核細(xì)胞濃度為2×106/ml，以10 ml分別加入2

12、5 ml的培養(yǎng)瓶中，置于37、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天半量換液并每周進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性檢測。造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)培養(yǎng)體系為: DMEM中含1%牛血清白蛋白（BSA），1%甲基纖維素和重組細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括： rhSCF 50 ng/ml，IL-3 10 ng/ml，GM-CSF 10 ng/ml，EPO 6 U/ml。標(biāo)本于24孔培養(yǎng)板中在37、5% CO2和飽和濕度下培養(yǎng)14天。每孔接種1 000個(gè)細(xì)胞，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，40個(gè)以上細(xì)胞為1個(gè)集落。CD34細(xì)胞檢測采用雙熒光標(biāo)記法，即收集分離后的單個(gè)核細(xì)胞，用PBS洗滌，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為106/ml，分別與CD34、

13、CD38單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30分鐘。PBS洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用x±SD表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。            作者：劉玉峰，張永卓，張傳新，王叼【摘】為了探討足月胎盤組織源單個(gè)核細(xì)胞(human mature placenta tissue-de         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收

14、集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。結(jié) 果CD34 細(xì)胞的分析胎盤組織、臍血中CD34 細(xì)胞及其亞群含量見表1。表1顯示胎盤組織中CD34 和CD34 /CD38-細(xì)胞群含量均大于臍血，這提示臍血中的CD34 細(xì)胞有可能來自胎盤。 Table 1. Quantitation of CD34 cells and subsets of CD34 cells from PT and CB（略)造血祖細(xì)胞集落的分析胎盤源細(xì)胞和臍血源細(xì)胞CFU-GM、BFU-E有明顯的區(qū)別（表2）。表2顯示胎盤組織源單個(gè)

15、核細(xì)胞產(chǎn)生的集落數(shù)量明顯高于臍血源，說明胎盤組織中含有更多的造血干/祖細(xì)胞。Table 2.    Colony formation of MNC from PT and CB (略)    長期培養(yǎng)的影響采用不加任何細(xì)胞因子的含血清的培養(yǎng)液，長期培養(yǎng)從胎盤組織和臍血中收集的單個(gè)核細(xì)胞，結(jié)果見附圖。由附圖可以看出，在長達(dá)14周的培養(yǎng)中，臍血中的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量在第4周開始下降，而胎盤組織源單個(gè)核細(xì)胞在第10周時(shí)，細(xì)胞數(shù)仍然在上升，比開始時(shí)的細(xì)胞數(shù)約增加1倍。多次培養(yǎng)結(jié)果顯示，臍血源單個(gè)核細(xì)胞在未加細(xì)胞因子的培養(yǎng)液中只

16、能存活5-7周，5周后細(xì)胞活性及有核細(xì)胞數(shù)明顯下降，出現(xiàn)成片的死亡細(xì)胞；而胎盤源細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞可存活長達(dá)10-12周，并且有大量的基質(zhì)細(xì)胞，呈成纖維樣和梭形。討 論自1989年世界上第1例臍血移植成功以來4，人們對(duì)臍血移植進(jìn)行了廣泛深入的研究。由于臍血中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量少，臨床應(yīng)用受到了限制，主應(yīng)用于兒童。由于成人骨髓造血干/祖細(xì)胞與外周血造血干/祖細(xì)胞移植存在高度的病毒感染機(jī)會(huì)和隨著年齡的增長造血干/祖細(xì)胞的增殖和分化潛能明顯下降，因此成體造血干/祖細(xì)胞的應(yīng)用也受到了限制5。故尋找新的造血干/祖細(xì)胞的來源是一個(gè)亟待解決的問題。本研究應(yīng)用酶消化的方法，從胎盤組織中分離得到造血干/祖細(xì)胞，應(yīng)

17、用流式細(xì)胞儀分析顯示: 胎盤源細(xì)胞較臍血源細(xì)胞含有更多的造血干/祖細(xì)胞。    最近，Alvarez-Silva等3 對(duì)小鼠胎盤造血功能的研究表明，在鼠胚胎發(fā)育過程中，胎盤造血干細(xì)胞數(shù)量最初為胎肝造血干細(xì)胞的2-4倍；在E9和E10胎盤中已有造血干細(xì)胞定居，而此時(shí)胎肝中還沒有造血干細(xì)胞定居；在E12時(shí)達(dá)到高峰，E17時(shí)開始下降。研究還表明，造血干細(xì)胞來源于胎盤的絨毛膜間質(zhì)而非胎盤的母體面組織。長期培養(yǎng)顯示，胎盤組織中的造血干/祖細(xì)胞具有更高的自我更新和增殖能力，說明胎盤在胚胎發(fā)育中具有造血功能。    CD34 細(xì)

18、胞被普遍認(rèn)為造血干/祖細(xì)胞，根據(jù)其細(xì)胞表面標(biāo)志CD38抗原的表達(dá)情況，又可分為CD34 /CD38 和CD34 /CD38-細(xì)胞兩大亞群，CD34 /CD38- 細(xì)胞是更為原始的造血干/祖細(xì)胞，具有更強(qiáng)的自我更新、增殖和分化能力。對(duì)胎盤源細(xì)胞和臍血源細(xì)胞的研究表明，胎盤源細(xì)胞中含有更多的CD34 細(xì)胞、CD34 /CD38-細(xì)胞，且在體外長期培養(yǎng)和造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)中顯示前者具有更高的自我更新、增殖和分化能力。這提示，臍血中的造血干/祖細(xì)胞有可能來自胎盤，且胎盤可能是在胎肝造血以前的造血器官。    胎盤可以分泌大量的細(xì)胞因子，曾風(fēng)華等6研究表明，胎盤具

19、有支持造血干/祖細(xì)胞生長的良好環(huán)境。1977年Burgess等7用制成的胎盤培養(yǎng)液證明了胎盤細(xì)胞可以分泌豐富的HGF。在胎盤源細(xì)胞體外長期培養(yǎng)中有大量的基質(zhì)細(xì)胞生長。2000年Jaroscak等8報(bào)道了從胎盤組織中分離培養(yǎng)出貼壁細(xì)胞，對(duì)其表面標(biāo)志研究發(fā)現(xiàn)，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞表面標(biāo)志上無明顯區(qū)別。2003年張毅等9報(bào)道了胎盤源貼壁細(xì)胞可以支持臍血CD34 細(xì)胞體外擴(kuò)增，說明了胎盤組織中的間充質(zhì)樣干細(xì)胞具有支持造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力。所有這些都表明胎盤在胚胎發(fā)育中具備造血干/祖細(xì)胞生長的適宜環(huán)境，且進(jìn)一步說明胎盤為一造血器官。    胎盤作為胎兒的附

20、屬物，是一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的暫時(shí)性器官。以上研究表明胎盤細(xì)胞成分較幼稚，胎盤組織源造血干/祖細(xì)胞較臍血造血干/祖細(xì)胞具有更高的增殖和分化能力，并且來源廣泛，方便易得，且污染機(jī)率小，故胎盤源細(xì)胞可以作為兒童和成年病人進(jìn)行造血干/祖細(xì)胞移植的又一良好的種子細(xì)胞。【參考文獻(xiàn)】1Ruggieri L，Herimfeld S，Broxmeyer HE. Cytokine-dependent ex vivo expansion of early subsets of CD34 cord blood myeloid progenitors is enhanced by cord blood plasma，but

21、expansion of the more mature subsets of progenitors is favored . Blood cells，1994；20: 436-4542Kurata H，Takakuwa K. Tanaka K. Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells in human cord blood: an effect enhanced by cord blood serum. Hematol Pathol，1995；9: 73-783Alvarez-Silva M，Belo-Diabangouaya

22、 P，Salaun J，et al. Mouse placenta is a major hematopoietic organ. Development，2003；130: 5437-54444Gluckman E，Broxmeyer HA，Auerbach AD，et al. Hematopoietic reconstitution of a patient with Fanconis anemia by means of umbilical cord blood from an HLA-identical sibling. N Engl J Med，1989；321:1174-11785Romanov YA，Svintsitskay