川芎嗪對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護(hù)作用及抗細(xì)胞凋亡作用(1)

1、川芎嗪對(duì)大鼠腎臟缺血/再灌注損傷保護(hù)作用及抗細(xì)胞凋亡作用(1)            作者：王漢民，譚華，趙洪雯，張鵬，黃朝暉，何麗潔，陳光磊，吳雄飛 【摘要】  目的: 探討川芎嗪對(duì)缺血/再灌注（I/R）損傷大鼠腎功能、腎臟組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響. 方法: 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（S）組、I/R組、再灌注后給予川芎嗪（TMPpost）組、再灌注前給予川芎嗪（TMPpre）組，各組分別采用化學(xué)法測(cè)定血尿素氮和肌酐，光鏡和電鏡觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化，原位

2、末端標(biāo)記法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)，免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)腎臟Bcl2和Bax蛋白的表達(dá). 結(jié)果: TMPpre組較I/R組血尿素氮和肌肝顯著降低，腎小管損傷評(píng)分減輕，分別為（21.8±5.2）vs (31.1±4.4) mmol/L，P0.01) ，（196±55）vs （295±64）mol/L，P0.01），(372±46) vs （563±62），P0.01) ；腎小管上皮細(xì)胞損傷及超微結(jié)構(gòu)改變明顯減輕，腎組織凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少（13.6±2.9） vs （28.8±4.6），P<0.01）；Bcl2蛋

3、白表達(dá)明顯增強(qiáng)（1.15±0.12） vs （0.88±0.12），P<0.05），Bax表達(dá)明顯減弱（0.87±0.11） vs （1.15±0.09），P<0.05）. 結(jié)論: 川芎嗪可明顯減輕I/R腎損傷，其保護(hù)作用機(jī)制與Bcl2蛋白表達(dá)增強(qiáng)和Bax蛋白表達(dá)減弱介導(dǎo)的腎臟細(xì)胞凋亡有關(guān). 【關(guān)鍵詞】  川芎嗪；腎臟；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；保護(hù)【Abstract】AIM: To explore Ligustrazine (Tetramethylpyrazine, TMP) on the effect of in rats wit

4、rat renal functions, renal tissue morphology, cell apoptosis and expressions of  related genes in rats with. METHODS: Forty Wistar rats of either sex were randomly divided into 4 groups, which were sham operation(n=10), I/R model(n=10), TMPpost (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg per 6 h after

5、reperfusion for 30 min) and TMPpre (n=10, intraperitoneal TMP 32 mg/kg at 45 min, 8, 16, 24 h before ischemia) groups. Blood urea nitrogen and creatinine were detected by chemical method. Renal cell apoptotic index was examined by means of terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nick end

6、labeling(TUNEL). The expressions of Bcl2 and Bax in kidney was immunohistochemically evaluated and quantified by Western Blot analysis. The kidney histology were observed by light and electron microscope. RESULTS: Compared with those in the TMPpre group, the blood urea nitrogen（21.8±5.2）vs (31.

7、1±4.4) mmol/L，P0.01, the creatinine （196±55） vs （295±64）mol/L，P0.01） and the score of injury in renal tubules (372±46) vs （563±62），P0.01) were decreased significantly in I/R group. The changes of injury and ultrastructure in tubular epithelial cells were significantly attenu

8、ated in TMPpre group. By Tetramethylpyrazine pretreatment, the apoptotic index (13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P<0.01) and the expression of Bax (0.87±0.11 vs 1.14±0.09, P<0.05) were decreased significantly, and the expression of Bcl2(1.15±0.12 vs 0.88±0.12, P<0.05) was

9、 increased significantly as compared with that in I/R group. CONCLUSION: Tetramethylpyrazine can attenuate kidney I/R injury, and protective mechanism may be partly through inhibition of cell apoptosis by regulating the expressions of apoptosisrelated genes Bcl2 and Bax.【Keywords】 tetramethylpyrazin

10、e; kidney; reperfusion injury; apoptosis; protection0  引言    川芎嗪是從傘形科植物川芎根莖中分離提純的一種生物堿單體，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等作用，臨床上廣泛用于心腦血管疾病的治療，并取得較好療效. 川芎嗪對(duì)腎臟缺血/再灌注（I/R）損傷的保護(hù)作用已被大量研究證實(shí)1-2，但這種保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚，我們通過(guò)觀察川芎嗪對(duì)I/R損傷大鼠腎功能、腎組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞凋亡及Bcl2和Bax蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討川芎嗪對(duì)腎I/R損傷的保護(hù)作用機(jī)制.1  材料

11、和方法1.1  材料  健康成年Wistar大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量200240 g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（軍2002005），標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食水，普通光照. 兔抗大鼠Bcl2和Bax mAb、兔抗actin（Santa Cruz公司）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；原位細(xì)胞凋亡(TUNEL)試劑盒（美國(guó)Roche公司）；細(xì)胞裂解液（美國(guó)BDBiosciences公司）；BCA試劑盒（美國(guó)Pierce公司）；SDS聚丙烯酰胺凝膠（美國(guó)Invitrogen公司）；硝酸纖維素膜（美國(guó)Life Science公司）；

12、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Cr）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；川芎嗪注射液（無(wú)錫第七制藥廠，批號(hào)02081911）. JEM100SX型透射電鏡（日本JEOL公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Kodak公司）等.1.2  方法1.2.1  分組及動(dòng)物模型制備  將40只大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只. S組：假手術(shù)對(duì)照組；I/R組：缺血再灌注模型組；TMPpost組：在I/R模型的基礎(chǔ)上，再灌注30 min后腹腔注射川芎嗪，32 mg/kg，每6 h 1次，共4次；TMPpre組：在制備I/R模型前24，16，8 h，45 min腹腔注射川芎嗪, 32 mg/

13、kg，I/R造模后不再注射川芎嗪. I/R模型制作參照Basile等方法進(jìn)行3，用30 g/L戊巴比妥鈉3050 mg/kg腹腔注射麻醉，經(jīng)腹正中切口暴露雙側(cè)腎臟，游離腎蒂，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾同時(shí)鉗夾雙側(cè)腎動(dòng)脈，阻斷45 min后松開(kāi)動(dòng)脈夾. 假手術(shù)組僅游離雙側(cè)腎臟，暴露60 min后再關(guān)閉腹腔切口. 24 h后再用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，采血并摘取左腎，血標(biāo)本以4000 r/min 離心10 min，分離血清，置-20保存用于測(cè)定BUN和Cr. 取部分腎組織分別用40 g/L甲醛和30 mL/L戊二醛固定以制備石蠟切片和電鏡切片，另取部分腎組織迅速置入液氮中，然后于-80冰箱保存，用于提取蛋白.1.

14、2.2  腎功能測(cè)定  測(cè)定血BUN采用二乙酰一肟顯色法，測(cè)定血Cr采用堿性苦味酸比色法，應(yīng)用721分光光度計(jì)測(cè)定.1.2.3  腎組織學(xué)觀察  石蠟切片行HE和PAS染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變，參照Paller等方法進(jìn)行評(píng)分4，每只大鼠腎組織隨機(jī)選擇10個(gè)視野（×200），每個(gè)視野下隨機(jī)選擇10處腎小管，共按100個(gè)腎小管計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷程度越嚴(yán)重. 電鏡切片行醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，在透射電鏡下觀察腎組織的超微結(jié)構(gòu)變化.1.2.4  腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)  采用TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)，參照TUNEL試劑

15、盒說(shuō)明書進(jìn)行，顯色采用DAB試劑盒進(jìn)行. 光鏡觀察凋亡細(xì)胞，胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞. 于陽(yáng)性表達(dá)分布區(qū)域、光鏡200倍下隨機(jī)選擇5個(gè)無(wú)重疊視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比作為細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）.1.2.5  腎組織Bcl2，Bax免疫組化染色  采用兔抗鼠Bcl2和Bax mAb，參照抗Bcl2和Bax試劑盒進(jìn)行，顯色采用DAB試劑盒進(jìn)行. 光鏡觀察胞質(zhì)中有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞.1.2.6  Western Blot檢測(cè)腎組織Bcl2，Bax蛋白表達(dá)  稱取腎組織，按常規(guī)加入細(xì)胞裂解液，進(jìn)行組織勻漿，取上清液用BCA試劑盒

16、進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)100 10 min 變性后，用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離. 電泳后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用麗春紅染液染膜，脫脂奶粉于室溫封閉，與Bcl2，Bax抗體37孵育4過(guò)夜. 搖洗并加入二抗室溫孵育，再次洗滌，滴加顯色液至硝酸纖維素膜上，X光膠片感光，用Kodak凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描.     統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：計(jì)量資料用 x±s表示，多組樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用多個(gè)均數(shù)間的多重比較（Dunnettt檢驗(yàn)），應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2  結(jié)果2.1腎功能的變化  各組血BUN和Cr變化見(jiàn)表1.表1  各組血BUN和Cr、凋亡指數(shù)及腎小管損傷程度評(píng)分的比較（略）aP0.05，bP0.01vs I/R組. S：對(duì)照組；I/R：缺血/再灌注組；TMPpost：I/R造模后給予川芎嗪；TMPpre：I/R造模前給予川芎嗪. 2.2  腎組織形態(tài)學(xué)改變  各組腎小管損傷程度評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1. S組光鏡觀察腎組織無(wú)明顯病變，電鏡亦未見(jiàn)明顯異常. I/R組光鏡可見(jiàn)皮髓間有明顯淤血帶，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣消失，出現(xiàn)空泡、滴狀變性，嚴(yán)重者細(xì)胞脫落、壞死、基底膜裸露. TMPpost組光鏡改變較I/R組有所減輕，而TM