定量研究EB病毒潛在膜蛋白對人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1的作用

1、    定量研究EB病毒潛在膜蛋白對人鼻咽癌細(xì)胞系CNE1的作用張欽明孫寧陳小毅 目的研究EB病毒LMP對人高分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE1細(xì)胞形態(tài)及DNA含量的影響。方法采用電穿孔基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組EBV-LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞株CNE1細(xì)胞。以載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及CNE1細(xì)胞為對照，用免疫熒光和圖像分析方法，觀察細(xì)胞LMP表達、細(xì)胞形態(tài)及DNA含量的變化。結(jié)果LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞漿及細(xì)胞膜LMP強陽性表達。形態(tài)定量及DNA含量測定表明，LMP表達后，CNE1細(xì)胞明顯變小(P0.01)，核漿比顯著增大(P0.01)，核漿的變化主要由胞漿面積的增減所致，

2、而與核面積的改變則無明顯正比關(guān)系；DNA含量明顯增高(P0.01/0.05)，且倍體分布更分散而右移。結(jié)論LMP對CNE1細(xì)胞生長有明顯的促進作用，可致細(xì)胞惡性程度增高且分化受抑，有向低分化鱗癌發(fā)展傾向，提示LMP在NPC的發(fā)生發(fā)展過程及其演進中可能起重要作用。 關(guān)鍵詞電穿孔鼻咽腫瘤EBV-LMP轉(zhuǎn)染圖像處理，計算機輔助細(xì)胞株/病理學(xué) MORPHOLOGICAL QUANTITATIVE STUDY ON HUMAN NASOPHARYNGEAL CARCINOMA CELL LINE CNE1 TRANFECTED WITH EB VIRUS LMP GENE Zhang Qinming,S

3、un Ning, Chen Xiaoyi.Dept.of Pathology,Guangdong Medical College,Zhanjiang 524023 Objective：Effects on human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE1 transfected by EBV-LMP gene were studied.Methods：Electroporation was used to transfect LMP gene and the vector into CNE1 cells. Immunofluorescenc

4、e technique (IFT) and image analysis technique were used. Results：:LMP gene was expressed stably on NPC CNE1 cells after transfection.The LMP expressive CNE1 cell showed that cytoplasmic area reduced significantly (P0.01) with a higher nuclear/cytoplasm ratio(P0.01),DNA content increased sufficientl

5、y (P0.01/0.05),chromosomal ploidy presented a wider distribution and shifted to right.The nuclear/cytoplasm ratio change chiefly caused by the reduction of cytoplasm area,not by the nuclear area.Conclusion：The EBV-LMP can promote the growth of NPC CNE1 cells,resulted in higher malignancy and poorer

6、differentiation.The CNE1 cells tends to change to low differentiated squamous cell carczinoma.These results indicated that LMP may have an important role on the progression of NPC cells. Key wordsElectroporationNasopharyngeal neoplasms EBV-LMP Transfection Image processing,computer-assistedDifferent

7、iationCell line/Pathology EBV(Epstein-Barr Virus)與鼻咽癌(NPC)關(guān)系十分密切1，而LMP(Latent Membrane Protein)則是目前所知EBV基因編碼的唯一具有轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞活性的蛋白，它可降低某些嚙齒類纖維母細(xì)胞株的血清依賴、接觸抑制及停泊依賴性生長23；LMP的表達伴有子宮頸上皮細(xì)胞表型變化及對終末分化信號反應(yīng)下降4。EBV-LMP在NPC發(fā)生發(fā)展中的作用及其作用機理如何，現(xiàn)在還不清楚。本文采用LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人高分化鼻咽癌細(xì)胞株(CNE1，不表達LMP的細(xì)胞)，觀察LMP對其形態(tài)和DNA含量的影響。 材料和方法 1.材料C

8、NE1癌細(xì)胞由本研究室提供；pCMVa載體質(zhì)粒及pCMVa-LMP重組質(zhì)粒由湖南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所陳主初教授惠贈；G481、LB培養(yǎng)基及PI(Propidium Iodide)，RPMI 1640培養(yǎng)液等均為美國Sigma公司產(chǎn)品；LMP(cs1-4)單克隆抗體、及FITC標(biāo)記的二抗為丹麥DAKO公司生產(chǎn)；細(xì)胞電穿孔儀(Gene Pulser)美國Bio-RAD公司產(chǎn)品；TJTY-500型全自動圖像分析系統(tǒng)(同濟醫(yī)科大學(xué))。 2.質(zhì)粒DNA的提取、鑒定及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染見文獻5C1組表示空白未經(jīng)轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞組；C1P組表示陰性對照組，即經(jīng)轉(zhuǎn)染pCMVa載體質(zhì)粒的CNE1細(xì)胞組；C1L組表示實驗組

9、，即LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CNE1細(xì)胞組。 3.LMP表達檢測將各組細(xì)胞涂片做LMP免疫熒光染色。同時設(shè)陽性(B95-8細(xì)胞)、陰性對照(一抗用PBS代替)。單抗皆1：50稀釋。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞LMP表達。 4.細(xì)胞培養(yǎng)分別將成功轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞及CNE1癌細(xì)胞置入含15%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液(加青霉素100 kU/L和鏈霉素100 mg/L)常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞長滿瓶后收集備用。 5.細(xì)胞形態(tài)參數(shù)測定細(xì)胞涂片HE染色后，參照文獻6從涂片中隨機選取510個視野，在圖象監(jiān)視器上顯示圖像，測定每個細(xì)胞的形態(tài)參數(shù)(胞面積、核面積、形狀因子和核形狀因子等)，并據(jù)胞面積和核面積計算出核漿比： 核漿

10、比=核面積/(胞面積-核面積) 6.細(xì)胞DNA含量測定參照文獻6每組測100個細(xì)胞以上，同時測正常人鼻咽上皮細(xì)胞30個，取其DNA含量(積分光密度)平均值作為正常2倍體(2C)細(xì)胞的DNA標(biāo)準(zhǔn)值，換算腫瘤細(xì)胞的相對DNA含量倍體數(shù)(U值)，計算機作數(shù)值處理，繪出直方圖。 7.數(shù)據(jù)處理本文數(shù)據(jù)資料采用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)程序作方差分析、q檢驗及U檢驗。 結(jié)果 1.LMP檢測LMP表達檢測顯示，C1組(空白組)及C1P組(對照組)LMP表達均陰性；C1L組(實驗組)細(xì)胞膜及細(xì)胞漿顯示強熒光，即LMP表達強陽性(見插頁第3頁圖2)，說明轉(zhuǎn)染成功。 圖2 轉(zhuǎn)染后CENI細(xì)胞LMP表達(免疫熒光染色) 2.轉(zhuǎn)染前

11、后細(xì)胞形態(tài)參數(shù)測定(見表1) 表1各組細(xì)胞胞面積、核面積及核漿比值檢測結(jié)果 細(xì)胞 胞漿面積(m2) 核面積(m2) 核漿比值 C1 359.14±54.71 441.91±68.41 1.32±0.17 C1P 306.97±58.56 419.28±61.63 1.36±0.30 C1L 209.26±61.47 373.87±75.70 2.03±0.22 (1)胞漿面積：CIL組胞漿面積顯著減少(與C1，C1P相比P0.01)；C1P組胞漿面積也較C1組小，但比較無顯著性差異(P0.05)，C1P組

12、胞漿面積減小幅度沒C1L組明顯。 (2)核面積：C1L組核面積小于C1組(P0.05)，C1P組的胞核面積雖然減小，但C1P組與C1組兩兩比較無顯著性差異(P0.05)，但與C1L組比較也無顯著性差異(P0.05)。 (3)核漿比：C1L組核漿比顯著大于C1和C1P組(P0.01)，說明CNE-1細(xì)胞經(jīng)EBV-LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞的核漿比有升高趨勢，結(jié)合胞漿面積的顯著減小，可見CNE1細(xì)胞表達LMP有向惡性度升高、小細(xì)胞化的發(fā)展趨勢；而C1P組盡管胞漿面積、胞核面積較C1組小，但無顯著性差異，細(xì)胞核漿比無顯著改變，與C1組相比P0.05，說明載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對CNE1細(xì)胞的惡性度無質(zhì)的影響。

13、 (4)細(xì)胞形狀因子：C1L組細(xì)胞形狀因子為1.73±0.19，大于C1P(1.49±0.18)組(P0.05)，而C1組為1.69±0.19，與C1L及C1P組比較無顯著性差異(P0.05)。 (5)核形狀因子：C1L組核形狀因子為1.83±0.32較C1組(1.67±0.19)增大，而C1P為1.57±0.17較C1則減小，兩者有差異(P0.01，P0.05)，C1L與C1則無差別(P0.05)。 3.細(xì)胞DNA含量及倍體分布特點細(xì)胞DNA含量檢測顯示，C1L組DNA含量均值高于C1及C1P組(P0.01，P0.05)，C1組與C

14、1P組比較則無顯著性(P0.05)。C1L組DNA含量直方圖DNA倍體分布寬而分散，34C顯著增多，達17.02%，5C為0.71%(見圖2)；C1組及C1P組DNA倍體分布集中，左移至2C前部，34C比C1L組顯著減少，C1組為5.88%，C1P為5.56%，兩組都沒有5C的細(xì)胞。 圖2C1L組細(xì)胞DNA倍體分布直方圖 *縱軸數(shù)值為百分率 討論 EBV與鼻咽癌的關(guān)系以往研究多著眼于NPC的發(fā)病學(xué)上，人們對EBV的研究多是基于其誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化而設(shè)計的，所得出的大量結(jié)果也證明其與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖和去分化有關(guān)13。Dauwson等在轉(zhuǎn)染LMP基因的人子宮頸永生化鱗狀上皮細(xì)胞株實驗表明，LMP的表達伴

15、有上皮細(xì)胞表型變化，抑制上皮細(xì)胞終末分化，角蛋白表達下降，在功能上似激活的ras蛋白4，提示EBV參與NPC多階段癌變，上皮細(xì)胞分化受抑制，停留在分化過程中的某一階段，因而增加了對各種致癌因素的敏感性，為進一步完成惡性轉(zhuǎn)化提供了條件。惡性腫瘤細(xì)胞的核染色體變化在于數(shù)量增減和結(jié)構(gòu)畸變，其異常必將影響到細(xì)胞形態(tài)及DNA含量的變化，因此測試病變細(xì)胞形態(tài)參數(shù)和DNA含量及倍體分布，可作為直接反映腫瘤生長分化的重要生物學(xué)指標(biāo)6，還有助于了解腫瘤生長分化過程中干系的選擇情況7。 本研究表明，CNE1及載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞為大細(xì)胞、低核漿比、高DNA含量且倍體分布寬而散的細(xì)胞群體，即為高分化鱗癌；LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

16、后CNE-1細(xì)胞變小，DNA含量增高，且倍體分布更分散而右移，此結(jié)果與目前公認(rèn)的惡性腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，其DNA含量越高，倍體分布也越寬、越分散的變化規(guī)律一致。形態(tài)測量同時發(fā)現(xiàn)LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞后，核漿的變化主要由胞漿面積的增減所致，而與核面積的改變則無明顯正比關(guān)系。核漿比一直是判斷細(xì)胞分化程度的一個重要指標(biāo)，它隨腫瘤惡性程度增加而遞增。本實驗的結(jié)果表明在判斷形態(tài)上差異較大的瘤細(xì)胞的增殖分化程度時，核漿比是一個良好的指標(biāo)，優(yōu)于其它形態(tài)參數(shù)。上述結(jié)果說明LMP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE1細(xì)胞后，使其形態(tài)參數(shù)、核漿比、DNA含量和倍體分布朝類似于低分化癌細(xì)胞的方向轉(zhuǎn)變。結(jié)合有關(guān)文獻報道的結(jié)果

17、23，提示EBV-LMP的表達，可使CNE1細(xì)胞亞群發(fā)生變化，出現(xiàn)一個或幾個優(yōu)勢的細(xì)胞亞群，亞群中細(xì)胞增殖能力增強而分化受抑制，從而影響整個細(xì)胞群體的生長分化。此外，觀察細(xì)胞形狀因子和核形狀因子的改變，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后變化不明顯或與細(xì)胞的形態(tài)變化無一定的相關(guān)性，提示在細(xì)胞形態(tài)參數(shù)測定時，形狀因子的測量不應(yīng)作為衡量細(xì)胞的增殖分化狀態(tài)的指標(biāo)。本研究結(jié)果提示EBV-LMP可能在NPC演進過程中起重要作用，值得進一步深入研究。 衛(wèi)生部立項課題編號：94-2-293 第一作者簡介張欽明，男，醫(yī)學(xué)碩士，講師。 作者單位：廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(湛江 524023) 參考文獻 1郭忠民，吳楓，沈淑靜，等

18、.EB病毒及化學(xué)致癌物DNP對人胚鼻咽粘膜裸鼠移植的誘癌研究.北京實驗動物科學(xué)，1992，9(4)：58 2Fahraeus R,Rymo L,Phim JS, et al. Morphological transformation of human keratinocytes expressing the LMP gene of EBV.Nature,1990,345:447 3Dawson CW,Eliopoulos AG,Dawson J, et al. EBV latent membrane protein inhibits human epithelial cell differentiation.Nature,1990,344:777 4Wang D,Liebowitz D, Kieff E ,et al. The trancated form of the EB virus latent-infectio