妍婷顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β的影響

1、妍婷顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的影響         【摘要】  目的研究中藥復(fù)方妍婷顆粒對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生白介素-1（IL-1）的影響，初步探討妍婷顆粒對(duì)慢性盆腔炎免疫調(diào)節(jié)的內(nèi)在機(jī)制。方法對(duì)經(jīng)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞給予不同濃度妍婷顆粒含藥血清進(jìn)行干預(yù)，用ELISA法檢測(cè)上清液中IL-1含量，用RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中IL-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果正常小鼠脾細(xì)胞合成和分泌少量IL-1，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后IL-1分泌量明顯升高（P0.01），IL-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)。不同濃度妍婷

2、顆粒干預(yù)呈劑量依賴方式降低LPS誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞IL-1的分泌量與表達(dá)（P0.01）。結(jié)論妍婷顆粒具有抑制LPS刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的作用，據(jù)此推測(cè)妍婷顆?？寡?、免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理可能與其抑制脂多糖介導(dǎo)的IL-1釋放有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  妍婷顆粒 脂多糖 小鼠脾細(xì)胞 白介素-1妍婷顆粒方為導(dǎo)師侯麗輝教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)與中醫(yī)理論相結(jié)合，總結(jié)出的治療慢性盆腔炎的經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床廣泛應(yīng)用多年，且療效顯著。慢性盆腔炎是婦科常見病、多發(fā)病，有纏綿不愈、易于復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，近年其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，因此對(duì)慢性盆腔炎的認(rèn)識(shí)與研究日益廣泛和深入。IL-1具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)、致熱、介導(dǎo)炎癥等作用，是慢性盆

3、腔炎發(fā)生發(fā)展的一種重要細(xì)胞因子。本研究觀測(cè)妍婷顆粒對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-1的影響，從分子免疫學(xué)角度探討妍婷顆粒治療慢性盆腔炎的機(jī)理和有效性。1  器材1  儀器與試劑超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）， 二氧化碳培養(yǎng)箱（SHEL·LAB）， 臺(tái)式高速離心機(jī)(BECKMAN)， 電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特）， AB204型電子天平(Sartorius)，磁力加熱攪拌器78-1（江蘇金壇）， 雙蒸水餾器(MILLI-Q)，752型分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）， PCR儀(Eppendorf), 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）。   改良

4、型RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone)，胎牛血清（杭州四季青），D-PBS（北京中山金橋）， LPS (Sigma)，Trizol(Lnvitrogen), 引物(Sangon), 氯仿（天津市天大化學(xué)試劑廠），異丙醇（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司），瓊脂糖(Solarbio)，PCR所需試劑購(gòu)自Promega及TakaRa公司，ELISA試劑盒（北京北方生物技術(shù)研究所）。2  動(dòng)物68周齡昆明雌性小鼠，體重2025 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。3  藥物  妍婷顆粒方組成：丹參、赤芍、元胡、三棱、莪術(shù)、紅藤、敗醬草、皂刺、川楝子。藥物來源于黑

5、龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室，制成中藥顆粒劑，蒸餾水溶解，最后濃縮含生藥濃度為1.75 g/ml。2  方法2.1  含藥血清的制備取體重2025 g的正常昆明雌性小鼠，按人鼠體重比換算后，以妍婷顆粒方灌胃（20 ml/kg，約相當(dāng)于成人用量的7倍），2次/d ，連續(xù)3 d，最后1次給藥后2 h，頸動(dòng)脈取血，以2 000 r/min離心5 min，分離血清，并于57滅活（30 min），20凍存?zhèn)溆?。2.2  小鼠脾細(xì)胞的分離培養(yǎng)小鼠頸椎脫位處死，置75%乙醇中浸泡35 min，仰臥位，無菌取脾臟，用D-PBS液沖洗，置于平皿中，移入超凈工作臺(tái)，再以濾過的D

6、-PBS快速、充分洗滌后，置于燒杯上的200目不銹鋼網(wǎng)，將脾組織用眼科剪剪成小塊，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮狀，D-PBS液沖洗過濾脾細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液無菌離心管中，1 500 r/min離心10 min，使細(xì)胞沉淀，棄上清，再以D-PBS液洗滌細(xì)胞2次，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次(均以1 500 r/min離心10 min)。以RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，含有青霉素、鏈霉素各100 u/ ml）懸浮細(xì)胞，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色顯示活力，細(xì)胞存活數(shù)大于90%，調(diào)整細(xì)胞密度，按1×106/ml密度接種細(xì)胞，置37，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后加LPS

7、及不同濃度妍婷顆粒進(jìn)行干預(yù)（LPS濃度為10 gml2；妍婷顆粒濃度分別為培養(yǎng)基的5%，10%，20%1）。2.3  實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組為正常組；LPS處理組（10 gml）；5%妍婷顆粒LPS處理組；10%妍婷顆粒LPS處理組；20%妍婷顆粒LPS處理組。2.4  實(shí)驗(yàn)檢測(cè)給予LPS及妍婷顆粒干預(yù)24 h3后收集上清及細(xì)胞。2.4.1  培養(yǎng)液上清中IL-1含量測(cè)定收集上清液20冰箱保存，按ELISA試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。2.4.2  RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中IL-1 mRNA的表達(dá)用Trizol提取細(xì)胞總RNA,測(cè)總RNA純度和含量,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,

8、IL-1的上游引物為:5-AGG CTC CGA GAT GAA CAA-3；下游引物為: 5-AAG GCA TTA GAA ACA GTC C-3, 產(chǎn)物長(zhǎng)度為464bp, PCR總反應(yīng)體為25l。擴(kuò)增條件為：95預(yù)變性5 min，然后在90 30 s，52.5 30 s，72 30s條件下循環(huán)3035次，最后72延伸10 min。PCR產(chǎn)物以 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),自動(dòng)凝膠成像分析儀下觀察并保存圖像，IL-1相對(duì)含量以“（細(xì)胞因子基因表達(dá)密度/GAPDH表達(dá)密度)×100%”表示4。2.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示,采用SPSS11.0for

9、 windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析,組間比較采用方差分析。         3  結(jié)果3.1  各組細(xì)胞上清液IL-1濃度變化   LPS 組分泌IL-1比正常組多,差異有顯著性(P0.01 ) 。含妍婷顆粒組(5%妍婷顆粒10g/ ml LPS，10%妍婷顆粒10g/ ml LPS，20%妍婷顆粒10g/ ml LPS) IL-1分泌量比 LPS組低,差異顯著性逐漸增強(qiáng)( P0.05,P0.05,P0.01)。見表1。表1  妍婷顆粒對(duì)LPS介導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞

10、分泌IL-1的影響（略）與正常組比較，P0.01；與LPS組比較，P0.05，P0.05，P0.013.2  RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IL-1mRNA的表達(dá)正常組IL-1mRNA的表達(dá)較弱,LPS 組IL-1mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng),含妍婷顆粒組IL-1mRNA的表達(dá)逐漸減弱。見圖1。圖1  妍婷顆粒對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-1 mRNA表達(dá)的影響（略）4  討論   慢性盆腔炎往往是多種病原體的混合感染，其中包括大腸桿菌、脆弱類桿菌、淋病奈氏菌、沙眼衣原體等多種革蘭氏陰性菌（G-），脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)菌感染的主要致病因子5。LPS也

11、稱細(xì)菌內(nèi)毒素，是構(gòu)成革蘭氏陰性菌（G-）細(xì)胞外壁的主要成分，可以從活體菌上緩慢釋放，菌體破碎后大量釋放到周圍環(huán)境中6。LPS是一種有效的免疫刺激劑，也是機(jī)體天然免疫系統(tǒng)識(shí)別的主要靶分子，它通過持續(xù)刺激機(jī)體細(xì)胞系統(tǒng)，可被宿主脂多糖結(jié)構(gòu)識(shí)別受體（如信號(hào)識(shí)別受體TOIL樣受體4，TLR4）識(shí)別，從而激活一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激發(fā)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞因子（如IL-1、TNF-等）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)已證明，LPS可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)7。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此建立免疫炎癥模型8，探討中藥妍婷顆粒免疫調(diào)節(jié)、抗炎治療的機(jī)理和有效性。   細(xì)胞因子是一種由細(xì)

12、胞產(chǎn)生的，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性、多功能的蛋白質(zhì)多肽分子，其功能為調(diào)控細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化和代謝活動(dòng)9。白介素-1（IL-1）不僅作為一種重要的細(xì)胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，也作為神經(jīng)遞質(zhì)和生長(zhǎng)因子參與機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的病理生理活動(dòng)。近年對(duì)IL-1的研究日益深入，其在各系統(tǒng)中的作用與機(jī)制得到相應(yīng)證實(shí)，為一些臨床疾病的診治提供了有力依據(jù)。IL-1主要由淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞在LPS等刺激劑作用后，合成和分泌大量IL-1（主要是IL-1為主）10。IL-1被稱為前炎癥因子11，機(jī)體受到感染或創(chuàng)傷時(shí)，由淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞最早產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-1，啟動(dòng)炎癥

13、級(jí)聯(lián)反應(yīng)，刺激體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生各種趨化因子（如補(bǔ)體片斷C5a，白細(xì)胞三烯LTB4，中性陽離子蛋白），促進(jìn)多種免疫分子（如TNF-，黏附分子等）基因表達(dá)和中性粒細(xì)胞釋放炎癥蛋白、炎癥介質(zhì)（如組胺、緩激肽、前列腺素），這些細(xì)胞因子在慢性盆腔炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。   中醫(yī)學(xué)認(rèn)為慢性盆腔炎的發(fā)生多由于經(jīng)期、產(chǎn)后攝生不慎，感受濕、熱、寒邪乘虛客于沖任、胞宮，邪正交爭(zhēng)，氣血運(yùn)行不暢，搏結(jié)成瘀所致，血瘀氣滯是本病發(fā)病關(guān)鍵，中醫(yī)藥在治療慢性盆腔炎方面有副作用小、療效高的優(yōu)勢(shì)。妍婷顆粒方為導(dǎo)師侯麗輝教授治療慢性盆腔炎的經(jīng)驗(yàn)方。方中赤芍、丹參清熱涼血，活血祛瘀，調(diào)經(jīng)止痛；延胡索、三棱、

14、莪術(shù)、川芎共奏活血散瘀，行氣消積止痛之功；紅藤、敗醬清熱解毒，活血止痛；皂角刺托毒排膿，活血消腫。諸藥合用，共同達(dá)到行氣活血，化瘀通絡(luò)止痛的作用，抑制免疫炎癥因子IL-1的釋放?，F(xiàn)代藥理研究證明12，妍婷顆粒方組成藥物具有抗菌、抗炎、改善血液流變性、抑制結(jié)締組織增生，使纖維溶解，抑制凝血，增強(qiáng)免疫的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，妍婷顆粒具有抑制免疫炎癥因子IL-1合成和釋放的功效,至于其調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥反應(yīng)的具體環(huán)節(jié)有待于進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 張玉環(huán)，陳保疆，王 萍,等.健脾補(bǔ)腎方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)小鼠脾細(xì)胞周期影響J.天津中醫(yī)藥，2006，23（1)：51.2 劉永平，管茶香

15、，白洪波,等.降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)LPS誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞分泌MMP-9 的影響J.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2007，23（2）：211.3 楊明煒,陸付耳,李鳴真,等.熱毒清對(duì)內(nèi)毒素體內(nèi)、外誘生腫瘤壞死因子的影響J.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6（8）：19.4 宋曉宇,鄭寧寧,孫 杰.RNA干擾對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞TNF2A表達(dá)的影響J.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，36（3）：285.5 宋慶賀,于欣平,陳蘇民,等.人Lrp蛋白在細(xì)胞中的定位及LPS對(duì)其表達(dá)的影響J.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2006，22（7)：542.6 楊 帆，楊秀榮.脂多糖與生物分子的相互作用及動(dòng)力學(xué)分析J.分析化學(xué)研究報(bào)告，2007，35（5）：677.7 李同麗，李 源，張革化.細(xì)菌脂多糖誘導(dǎo)離體鼻黏膜上皮細(xì)胞致炎后p38MAPK的活性變化及意義J.臨床耳鼻咽喉科雜志，2005，19（13）：607.8 吳 麗，張玲玲，孫嫵弋，等.國(guó)產(chǎn)白介素-1受體阻滯劑對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能的影響J.中國(guó)新藥雜志, 2005,14(3)：295.9