大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR12b啟動子的克隆及活性分析_周小瓊_圖文

1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015,48(8:1650-1659Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.20大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR1;2b啟動子的克隆及活性分析周小瓊,丁一瓊,左 麗,喻德躍(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家大豆改良中心/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,南京 210095摘要:【目的】硫轉(zhuǎn)運蛋白(sulfate transporter,SULTR參與根系對外界環(huán)境中硫酸根(SO42-的吸收與轉(zhuǎn)運。大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR1;2b在根中特異表達(dá),其功能是將外界的SO42-吸收轉(zhuǎn)運到植物根系

2、中。文章克隆大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白GmSULTR1;2b的啟動子,研究該啟動子的驅(qū)動活性和組織表達(dá)情況,從而了解GmSULTR1;2b的調(diào)控機(jī)制,為提高大豆含硫氨基酸含量提供分子依據(jù)?！痉椒ā扛鶕?jù)NCBI中GmSULTR1;2b的序列,分析預(yù)測該基因上游2 259 bp為啟動子,并利用在線數(shù)據(jù)庫PLACE和Plant-CARE預(yù)測該啟動子序列的調(diào)控元件。以大豆品種南農(nóng)N2899的DNA為模板,進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增,將克隆的啟動子序列與GUS連接構(gòu)建植物重組表達(dá)載體pSULTR1;2bGUS。利用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大豆進(jìn)行瞬時表達(dá),以GUS為報告基因?qū)?/p>

3、啟動子的活性進(jìn)行分析。另外,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599中進(jìn)行大豆毛狀根轉(zhuǎn)化試驗,借助于GUS報告基因,通過體視鏡觀察毛狀根的橫切面,分析啟動子在根中的表達(dá)情況。最后以轉(zhuǎn)化的陽性毛狀根為材料,通過GUS酶活試驗(GUS activity分析啟動子的活性?！窘Y(jié)果】克隆大豆品種南農(nóng)N2899的GmSULTR1;2b啟動子與NCBI序列基本一致。通過在線預(yù)測分析啟動子的調(diào)控元件發(fā)現(xiàn)該啟動子具有真核生物啟動子必須的核心元件TATA-box外,還含有激素應(yīng)答元件ERE(乙烯響應(yīng)元件、ABRE(脫落酸響應(yīng)元件等,脅迫應(yīng)答元件TC-rich repeats(干旱脅迫以及病蟲害脅迫、AT-rich ele

4、ment(AT-rich的DNA與蛋白結(jié)合位點和MYB等。重組載體pSULTR1;2bGUS經(jīng)PCR和測序鑒定,證實已構(gòu)建成功。大豆瞬時表達(dá)后進(jìn)行X-gluc染色顯示,重組載體侵染的大豆顯藍(lán)色,說明GmSULTR1;2b啟動子能夠驅(qū)動下游GUS的表達(dá)。對轉(zhuǎn)化的毛狀根染色之后,體視鏡下觀察陽性根的橫切面,發(fā)現(xiàn)GUS主要在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達(dá),表明GmSULTR1;2b啟動子主要在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達(dá)。對轉(zhuǎn)化毛狀根進(jìn)行GUS酶活試驗(GUS activity說明該啟動子的啟動活性比CaMV35S啟動子的啟動活性弱?！窘Y(jié)論】克隆了GmSULTR1;2b啟動子序列,該啟動子具有驅(qū)動下游GUS的

5、表達(dá)的功能,而且該啟動子在根毛、根表皮和中柱內(nèi)表達(dá)。關(guān)鍵詞:大豆;GmSULTR1;2b;啟動子;瞬時表達(dá);GUS活性Cloning and Activity Analysis of the Promoter of SulfateTransporter Gene GmSULTR1;2bZHOU Xiao-qiong, DING Yi-qiong, ZUO Li, YU De-yue(College of Agronomy, Nanjing Agricultural University/National Center for Soybean Improvement/National Key L

6、aboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095Abstract: 【Objective】Following the nitrogen, phosphorus and potassium, sulfur is the fourth nutrient necessary for the plants. Sulfur-containing organic compounds involved in many important physiological and biochemical reactions in

7、 plants, which play an important role in withstanding environmental stress and growth and development of plants. Sulfate transporters (sulfate transporter, SULTR participate in absorption and transportation of the exogenous sulfate(SO42-. The sulfate transporter gene GmSULTR1;2b of soybean is specif

8、ically expressed in the root, which plays a role in transporting sulfate from the environment.收稿日期:2014-09-19;接受日期:2014-12-29基金項目:國家“973”重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2010CB125906聯(lián)系方式:周小瓊,Tel:150*;E-mail:2012101143。通信作者喻德躍,E-mail:dyyu8期周小瓊等:大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR1;2b啟動子的克隆及活性分析 1651Cloning the promoter of GmSULTR1;2b, and s

9、tudying on its activity and tissue expression will contribute to understanding theregulatory mechanism of GmSULTR1;2b. It can also provide a molecular foundation for improving the content of sulfur aminoacid in soybean.【Method】According to the sequence of GmSULTR1;2b in the NCBI, the predicted 2 259

10、 bp upstream wasanalyzed and predicted as the promoter. The online debases PLACE and Plant-CARE were used to prognose the regulatoryelements of the sequence. The sequence was obtained by PCR through taking the soybean cultivars Nannong N2899 DNA astemplate. The sequence was fused with GUS to constru

11、ct the plant expression vector pSULTR1;2b:GUS. The binary vectorconstructs were transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 by the freeze-thaw method. The transient expression assayswere carried out in soybean by Agrobacterium tumefaciens-mediated method, and the activity of the promoter was a

12、nalyzed byusing GUS as the reporter gene. In addition, hairy root transformation experiment was carried out by transforming the binaryvector constructs into Agrobacterium rhizogenes K599. By analyzing the transverse section of the hairy roots under thestereoscope, its expression was observed. Finall

13、y, the GUS activity was implemented to test the activity of the promoter, whichwas based on the positive transformed hairy roots.【Result】The cloned promoter sequence of GmSULTR1;2b from NannongN2899 was basically in line with the sequence in NCBI. Through online prediction analysis of regulatory ele

14、ments, it was foundthat the promoter contained not only TATA-box, which was the necessary component of eukaryote, but also contained hormoneresponse element ERE (ethylene response element, ABRE (abscisic acid response element, stress response element TC - richrepeats (diseases and insect pests stres

15、s and drought stress, the AT - rich element (the DNA of AT - rich and protein binding sitesand MYB, etc. The successful construction of the recombination vector pSULTR1;2b:GUS was confirmed via PCR andsequencing appraisal. The X-gluc dyeing conducted on the transient expression of soybean showed blu

16、e where the soybean wasinfected by the recombinant vector pSULTR1;2b:GUS. It indicated that the promoter could drive GUS expression downstream.After staining the transformed hairy roots, the transverse section of the positive hairy roots was analyzed under the stereoscope.The GUS was mainly found in

17、 the root hair, root epidermis and the stele, which manifested the promoter mainly expressed in theroot hair, root epidermis and the stele. The GUS activity test of the transformed hairy roots attested weaker activity than thepromoter of CaMV35S.【Conclusion】GmSULTR1;2b promoter was cloned. It could

18、drive GUS in the downstream, and express inthe root hairs, root epidermis and the column.Key words: soybean; GmSULTR1;2b; promoter; transient expression; GUS activity0 引言【研究意義】硫是植物繼氮、磷、鉀之后的第四個重要元素,對大豆(Glycine max(L. Merr.尤為重要1-2。大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白(sulfate transporter,SULTR家族負(fù)責(zé)吸收轉(zhuǎn)運外界環(huán)境的SO42-。SO42-通過植物根系進(jìn)入植物體內(nèi)進(jìn)行

19、還原同化作用,生成一系列重要化學(xué)物質(zhì)3-5。啟動子控制基因的表達(dá),研究大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子對于了解該基因的調(diào)控機(jī)制有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】編碼硫轉(zhuǎn)運蛋白基因最先由酵母菌的功能互補(bǔ)試驗所鑒定,通過對酵母硫轉(zhuǎn)運蛋白(SULTR缺失的突變體酵母菌株進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗確定了該基因所編碼的蛋白具有SO42-轉(zhuǎn)運功能6-7。后來許多硫轉(zhuǎn)運蛋白(SULTR在不同植物中克隆出來8-10。在植物中硫轉(zhuǎn)運蛋白是由許多成員組成的硫轉(zhuǎn)運蛋白家族,該家族在不同的植物中由1216個基因組成,根據(jù)功能差別將其分成不同的亞家族11。在擬南芥中,硫轉(zhuǎn)運蛋白家族由14個基因組成,明顯地分成5個不同的功能亞家族,但是研究表

20、明擬南芥第五亞家族的2個基因是鉬轉(zhuǎn)運蛋白12-14。通過對擬南芥突變體的分析確認(rèn)了2個密切相關(guān)的硫轉(zhuǎn)運蛋白SULTR1;1和SULTR1;2,能促使硫酸鹽進(jìn)入根,特別是在硫限制的情況下15-16。進(jìn)一步研究證明二者主要在根毛、根表皮和皮層細(xì)胞內(nèi)表達(dá)17-19。丁一瓊等20克隆了大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR1;2b, GmSULTR1;2b與擬南芥ATSULTR1;2蛋白序列相似性為83%。通過酵母互補(bǔ)試驗證明該基因可以互補(bǔ)sul1和sul2的缺陷,具有SO42-轉(zhuǎn)運活性。通過半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在根中特異表達(dá),能響應(yīng)環(huán)境脅迫。所以GmSULTR1;2b很可能是負(fù)責(zé)從土壤中吸收S

21、O42-的高親和性硫轉(zhuǎn)運蛋白。發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes侵染植物后,能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生分支的不定根,也稱為發(fā)狀根或毛狀根21。培養(yǎng)毛狀根可以用于生產(chǎn)植物次級代謝產(chǎn)物22-24,研究與根發(fā)育相關(guān)基因的研究25,也用于分析啟動子的功能26。【本研究切入點】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心先前對大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白家族進(jìn)行了深入研究,對GmSULTR1;2b的功能進(jìn)行初步驗證,但未對該基因的啟動子進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用普通PCR方法克隆GmSULTR1;2b上游啟動子,1652 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)48卷分析啟動子序列,并構(gòu)建表達(dá)載體驗證該啟動子的活性,通過大豆毛狀根

22、轉(zhuǎn)化試驗對啟動子活性進(jìn)行定量檢測,有助于了解大豆GmSULTR1;2b的調(diào)控模式,也為今后相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究提供理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料大豆品種南農(nóng)N2899,由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心種質(zhì)資源庫提供,播種于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗基地,自然條件下生長。細(xì)菌材料:大腸桿菌(Escherichia coliDH5購于天根生化科技有限公司。根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株K599由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心保存。植物表達(dá)載體pCAMBIA1381Z和pCAMBIA1301由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家大豆改良中心保存。1.2 DNA的提取以及引物設(shè)計以大豆品種南農(nóng)N2899為材料,在正

23、常生長季節(jié)將大豆種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗基地,選取生長良好的幼嫩葉片,采用CTAB法提取葉片基因組DNA27。根據(jù)NCBI上比對獲得的大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因(命名為GmSULTR1;2b,登錄號Gene ID: 100806204轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS上游和下游序列設(shè)計2對特異引物QDZ1-F/R和QDZ2-F/R用于擴(kuò)增約2.3 kb的序列(表1。其中,上游引物在轉(zhuǎn)錄起始位點TSS上游2 190 bp,下游引物在TSS后69 bp。表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences引物名稱 Primer name 引物序列Primer sequence (5-3 擴(kuò)增長

24、度PCR product length (bp 退火溫度Annealing temperature ( QDZ1 F:AAATTGGCGGTCAACGGCTACGCTC 2259 63 R:GAAACCAAAAGGCCCAGTGAAAGTACCQDZ2 F:CGCCTTTGCGTATGGAGTGGAGTCTA 2178 62 R:GAAACCAAAAGGCCCAGTGAAAGTACC1.3 啟動子的克隆及序列分析以大豆品種南農(nóng)N2899的DNA為模板,用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo擴(kuò)增啟動子全長序列。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,條帶大小與目的片段一致,用PCR回收試劑盒回

25、收純化PCR產(chǎn)物,回收后產(chǎn)物與T載體重組,然后按照分析克隆28將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5。經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的樣品送到上海桑尼生物科技有限公司測序驗證。測序正確的菌液提取質(zhì)粒并命名為PTA2- pSULTR1;2b。測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對,比對正確的序列用植物順式元件數(shù)據(jù)庫PLACE(plant cis-acting regulatory DNA elements,www. Dna. Affrc. Go. jp /PLACE /29和數(shù)據(jù)庫Plant-CARE(plant cis- acting regulatory element,http: /bioinformatics

26、. Psb. Ugent. be /webtools /plantcare /html/30在線預(yù)測分析啟動子可能存在的順式作用元件。1.4 構(gòu)建植物表達(dá)載體以測序正確的質(zhì)粒PTA2-pSULTR1;2b為模板,添加酶切位點(正向引物中添加Bam H酶切位點,反向引物中添加Nco酶切位點的特異引物(P2248F:5-ACGCGGATCCAACGGCTACGCTCTC CATTCAA-3,P2248R:5-CATGCCATGGAAACCA AAAGGCCCAGTG -3進(jìn)行PCR擴(kuò)增(下劃線表示酶切位點。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物和目的片段大小一致。將目的片段回收后與載體pCAMBIA13

27、81Z都用Bam H和Nco進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5、提取質(zhì)粒并用PCR驗證。把陽性克隆送至上海桑尼生物科技有限公司測序進(jìn)一步驗證啟動子片段是否已經(jīng)正確連接到載體pCAMBIA1381Z上。1.5 大豆瞬時表達(dá)、毛狀根轉(zhuǎn)化及啟動子活性分析 1.5.1 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆瞬時表達(dá) 將測序正確的質(zhì)粒命名為pSULTR1;2bGUS。通過凍融法31將融合載體pSULTR1;2bGUS以及載體pCAMBIA1301(陽性對照:CaMV35SGUS和pCAMBIA1381Z(陰性對照:無啟動子分別轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium菌株EHA105中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)的方法進(jìn)

28、行遺傳轉(zhuǎn)化32-33:挑取根癌農(nóng)桿菌EHA105單克隆,接種在含卡那霉素(50 g·mL-1的液體YEB培養(yǎng)基中,220 r/min、28過夜培養(yǎng)。用分光光度計測OD600 =1.21.5。室溫下, 4 000 r/min離心10 min,棄上清,用液體MS(含150 mmol·L-1乙酰丁香酮重懸浮菌體,至OD600 =0.28期周小瓊等:大豆硫轉(zhuǎn)運蛋白基因GmSULTR1;2b啟動子的克隆及活性分析 16530.5。挑選無病、飽滿的大豆種子平鋪于90 mm的培養(yǎng)皿中,利用NaClO和濃HCl反應(yīng)產(chǎn)生Cl2 對大豆種子進(jìn)行滅菌,68 h后取出大豆種子,于超凈工作臺中吹2

29、h左右。將滅菌的種子接種于MS上,在25、光照16 h/黑暗8 h條件下培養(yǎng)34 d。用手術(shù)刀切下胚軸至5 cm左右(距離子葉節(jié)5 cm,去掉種皮,沿著子葉節(jié)下胚軸垂直剖開種子,并在子葉和子葉下胚軸連接處垂直于胚軸處制造傷口,同時在下胚軸處也制造傷口。將子葉加入到懸浮好的菌液中,于28, 100 120 r/min侵染30 min,然后吸干菌液轉(zhuǎn)移到固體MS上,25、黑暗條件下培養(yǎng)34 d。1.5.2 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化 通過凍融法31將融合載體pSULTR1;2bGUS以及載體pCAMBIA1301(陽性對照分別轉(zhuǎn)化至發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes

30、菌株K599中。大豆根毛的遺傳轉(zhuǎn)化方法34:挑取發(fā)根農(nóng)桿菌K599單克隆,接種在含卡那霉素(50 g·mL-1的液體YEB培養(yǎng)基中, 220 r/min、28過夜培養(yǎng)。用分光光度計測OD6000.8。室溫下,3 000 r/min離心10 min,棄上清,用10 mmol·L-1 MgCL2重懸浮,稀釋至終濃度OD600為0.60.8備用。種子滅菌方法同上。將無菌大豆種子種在1/2 MS培養(yǎng)基中,在25、光照16 h/黑暗8 h條件下培養(yǎng)56 d。在超凈工作臺中去掉大豆種皮,用手術(shù)刀切下大豆子葉,用無菌刀在每個子葉背部挖一個小洞,把子葉轉(zhuǎn)移到含頭孢和羧芐霉素(250 g&#

31、183;mL-1的Whiter培養(yǎng)基上。將稀釋好的菌液滴到洞里,于25暗培養(yǎng)1520 d。1.5.3 GUS染色及活性分析 參照J(rèn)efferson等35方法測定大豆組織中GUS報告基因的表達(dá)情況。將待染色的外植體浸泡在GUS染色液(50 mmol·L-1磷酸鈉緩沖液pH 7.0、10 mol·L-1 EDTA、0.1% Triton X-100、1 mmol·L-1 /L K3Fe(CN6、1 mmol·L-1 K4Fe(CN6、1 mmol·L-1 X-Gluc中,置于37中保溫過夜,用70%乙醇沖洗脫色,直至底色完全消失,在體視鏡下拍照觀察

32、結(jié)果。將需要測定GUS酶活的材料置研缽中加液氮研磨成粉末加入提取緩沖液(50 mmol·L-1 NaH2PO4 (pH7.0、10 mmol·L-1 EDTA、0.1% Triton X-100、0.1(w/v十二烷基磺酸鈉、10 mmol·L-1-巰基乙醇, 4,12 000 r/min離心10 min,此時的上清即為GUS 蛋白提取液。用BSA法測定蛋白濃度。取出部分加GUS反應(yīng)底物4-MUG,于37反應(yīng)30 min,在激發(fā)光365 nm發(fā)射光455 nm的條件下進(jìn)行熒光測定,3次生物重復(fù),最終以單位時間內(nèi)產(chǎn)物的相對變化量來計算GUS酶活性值。2 結(jié)果2.1

33、啟動子的克隆與序列分析根據(jù)設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分別得到約2.3 kb的條帶,測序結(jié)果顯示,擴(kuò)增序列與大豆基因組數(shù)據(jù)庫的序列基本一致,該序列可以用于下步試驗。把轉(zhuǎn)錄起始位點TSS(transcriptional start site的第一個堿基定義為+1,將克隆的2 259 bp的序列進(jìn)行在線預(yù)測,結(jié)果(圖1顯示GmSULTR1;2b啟動子不僅含有真核生物啟動子必須的核心元件TATA-box,還含有其他調(diào)控元件。(1激素應(yīng)答元件:ERE(乙烯響應(yīng)元件、ABRE(脫落酸響應(yīng)元件、TCA-element(水楊酸響應(yīng)元件、P-box(赤霉素響應(yīng)元件。(2光響應(yīng)元件:Box1、Box4、 G-Bo

34、x、ACE等。(3脅迫應(yīng)答元件:TC-rich repeats(干旱脅迫以及病蟲害脅迫、HSE(熱脅迫等。(4結(jié)合位點:AT-rich element(AT-rich的DNA與蛋白結(jié)合位點、CCAAT-box(MYBHv1結(jié)合位點、 MBS(MYB結(jié)合位點以及MYB等。2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建將得到的啟動子片段(2 259 bp雙酶切并連接到載體pCAMBIA1381Z(只有GUS,沒有啟動子上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,表明GmSULTR1;2b啟動子已經(jīng)插入到pCAMBIA1381Z中重組質(zhì)粒(圖2。2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆瞬時表達(dá)及GUS染色將重組表達(dá)載體pSULTR

35、1;2bGUS、pCAMBIA1301以及pCAMBIA1381Z轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中,其中, pCAMBIA1301載體為陽性對照(CaMV35SGUS, pCAMBIA1381Z載體為陰性對照(只有GUS,沒有啟動該基因的啟動子。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行瞬時表達(dá)。從圖3中顯示轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301載體(圖3-A以及重組載體pSULTR1; 2bGUS(圖3-B的農(nóng)桿菌侵染大豆后均能檢測到GUS的表達(dá)產(chǎn)物,說明克隆的GmSULTR1;2b啟動子能夠驅(qū)動下游基因GUS的表達(dá),也就是說該啟動子片段具有驅(qū)動活性。但是目的載體GUS染色沒有陽性對照(CaMV35S啟動子染色

36、深,說明其活性比CaMV35S啟動子的活性低。pCAMBIA1381Z載體沒有啟動子驅(qū)動GUS的表達(dá),所以檢測不到GUS表達(dá)(圖3-C。1654 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)48卷 圖1 GmSULTR1;2b啟動子的序列分析Fig. 1 Nucleotide sequence analysis of GmSULTR1;2bpSULTR1;2b GUSpSULTR1;2b promoterBam H Nco (0Ahd1GUSGUSCaMV 35SHygCaMV 5UTRNOS 3UTR Pml1Sph1Psi1KanTB T-DNA repeatRB T-DNA repeatbom site11226 bp

37、SgrA1Bsa1Acl1圖2 重組質(zhì)粒pSULTR1;2b GUS 圖譜Fig. 2 The carrier structure of recombinant plasmid of pSULTR1;2b GUS A :pSULTR1;2b GUS 瞬時表達(dá);B :CaMV35S GUS 瞬時表達(dá);C :陰性對照A: Transient expression of pSULTR1;2b GUS; B: Transient expression of CaMV35S GUS; C: CK圖3 大豆子葉節(jié)瞬時表達(dá)結(jié)果Fig. 3 Results of transient expression in

38、 soybean cotyledon section2.4 發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化以及GUS 活性分析大豆的GmSULTR1;2b 與擬南芥的ATSULTR1;2同源性很高,蛋白序列相似性為83%20。ATSULTR1;2的啟動子能夠驅(qū)動下游GFP 在根毛、根表皮、根的皮層細(xì)胞以及葉片的保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)19。丁一瓊等20研究發(fā)現(xiàn)大豆GmSULTR1;2b 也在根中特異表達(dá)。為了驗證GmSULTR1;2b 啟動子在根中的穩(wěn)定表達(dá)情況,進(jìn)行大豆毛狀根穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行驗證。載體pSULTR1;2b GUS 及pCAMBIA1301通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo),穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大豆。將新長出的8 cm

39、左右的毛狀根取出,進(jìn)行GUS染色,進(jìn)一步定性檢測GmSULTR1;2b啟動子的活性以及其在根毛中的表達(dá)情況。測定GUS酶活,定量判斷GmSULTR1;2b 啟動子的表達(dá)。對轉(zhuǎn)基因根毛組織染色結(jié)果如圖4(A、C,表明GmSULTR1;2b啟動子和CaMV35S啟動子都能在轉(zhuǎn)基因大豆根毛中驅(qū)動報告基因的表達(dá),但是GmSULTR1;2b啟動子的活性比CaMV35S啟動子的活性低,這和上面結(jié)果(圖3一致。為了定量檢測GmSULTR1;2b啟動子和CaMV35S啟動子的活性,進(jìn)行了GUS酶活測定試驗(圖5。從圖5可以看出GmSULTR1;2b啟動子的活性比CaMV35S啟動子的低,這和上面結(jié)果一致。為了

40、解GmSULTR1;2b啟動子在根組織中的表達(dá)情況,觀察染色后根毛的橫切面。從圖4(B、D中可看出GUS在根毛、根表皮、根的皮層細(xì)胞和中柱中有表達(dá),這和擬南芥ATSULTR1;2啟動子的表達(dá)情況類似18-19。 A、C:分別是pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS轉(zhuǎn)化大豆毛狀根后GUS染色;B、D:分別是pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS轉(zhuǎn)化大豆根毛后的根橫切面A,C: GUS staining of pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS in transgenic soybean root hair, respectively; B,D: The GUS

41、staining of root transverse section of pSULTR1;2bGUS和CaMV35SGUS in transgenic soybean root hair, respectively圖4 大豆根毛轉(zhuǎn)化的GUS染色Fig. 4 Histochemical analysis of GUS staining in transgenic soybean root hair GUS酶活(單位:UGUSactivity(Units A、B表示顯著性差異(P<0.001A, B indicate significant difference (P<0.001圖

42、5 大豆毛狀根轉(zhuǎn)化的GUS酶活分析Fig. 5 Enzymatic assay of GUS activity in transgenic soybeanhairy roots3 討論擬南芥的2個高親和硫轉(zhuǎn)運蛋白SULTR1;1和SULTR1;2同源性為72.6%,負(fù)責(zé)把SO42-從土壤中吸收到根部15-16,19。雖然存在一定的冗余功能和表達(dá)模式,但是SULTR1;2仍然是負(fù)責(zé)硫吸收以及轉(zhuǎn)運的主要組成部分15,19。最近研究表明ATSULTR1;2可能在感應(yīng)硫濃度機(jī)制中參與調(diào)控作用36。SULTR1;1由于Km值更低,能特異吸收環(huán)境中微量的SO42-,缺硫時受到強(qiáng)烈誘導(dǎo)16,19。SULTR

43、1;3在韌皮部表達(dá),且負(fù)責(zé)硫從源到庫的再分配37。SO42-進(jìn)入植物根之后,SULTR2;1主要負(fù)責(zé)把硫從根轉(zhuǎn)運到莖38-40。第3亞家族以及第4亞家族SULTR3和SULTR4的基因負(fù)責(zé)把SO42-進(jìn)一步轉(zhuǎn)運到葉綠體40-41以及胞質(zhì)42中。擬南芥中硫轉(zhuǎn)運蛋白家族基因之間相互協(xié)調(diào)共同把SO42-從外界環(huán)境吸收進(jìn)入植物體內(nèi)并轉(zhuǎn)運到相應(yīng)組織中進(jìn)一步進(jìn)行同化代謝。GmSULTR1;2b為SULTR第1亞家族的基因,具有硫轉(zhuǎn)運活性,在根中特異表達(dá),且能夠響應(yīng)低硫脅迫20。高等植物基因的表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控,但是主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上,受多種順式作用元件與反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用。啟動子是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控中

44、重要的順式作用元件,是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心,在一定程度上決定了目的基因表達(dá)的時間和空間順序。因此,在植物遺傳工程研究中,對啟動子的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行研究是了解植物基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理的關(guān)鍵,也是開展植物基因工程研究首要解決的問題。已經(jīng)通過研究擬南芥硫轉(zhuǎn)運蛋白基因的啟動子,表明基因的主要表達(dá)部位18-19,Chai等43通過5端和3端刪除分析找到一個核心啟動子區(qū)域,并對該區(qū)域進(jìn)行人工組合,且該合成的啟動子能夠受到疫霉(Phytophthora sojae的誘導(dǎo),可以用于植物抗病新品種的培育。大豆中氨基酸含量不均衡,含硫氨基酸含量很低,限制了其營養(yǎng)品質(zhì)。期望通過基因工程方法調(diào)節(jié)硫代謝途徑的SO42-流的分布

45、,為提高含硫氨基酸含量提供依據(jù)。本研究從大豆基因組中克隆了GmSULTR1;2b啟動子片段。通過序列分析表明該啟動子具有除了具有TAAT-box外,還具有激素應(yīng)答元件ABRE、脅迫應(yīng)答元件以及MYB等。研究GmSULTR1;2b時發(fā)現(xiàn)該基因在0.2 mol·L-1甘露醇處理模擬干旱處理下,過表達(dá)GmSULTR1;2b轉(zhuǎn)基因煙草的鮮重、根長以及側(cè)根數(shù)都要比對照顯著提高。而在0.4 mol·L-1甘露醇處理下對照與轉(zhuǎn)基因煙草的鮮重、根長與側(cè)根數(shù)沒有顯著性的差異20。由此可見,過表達(dá)GmSULTR1;2b能在一定程度上提高煙草植株的抗逆能力。這可能和啟動子的結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系,但這

46、一結(jié)論還需要更多的試驗數(shù)據(jù)支撐。這些順式作用元件的預(yù)測可以為酵母單雜交試驗提供一個理論依據(jù),也為該基因調(diào)控模式的研究提供一個理論基礎(chǔ)。通過研究AtSULTR1;1啟動子5區(qū)域表明存在植物激素響應(yīng)因子,對轉(zhuǎn)基因擬南芥AtSULTR1;1啟動子片段5和3端刪除分析,鑒定到一個位于ATSULTR1;1啟動子-2 777-2 762 bp處能夠響應(yīng)低硫的順式作用元件SURE(sulfur-responsive element44。但是SURE存在于ATSULTR1;1啟動子中,ATSULTR1;2中不存在44,同樣在GmSULTR1;2b 啟動子序列中也沒有發(fā)現(xiàn)SURE順式作用元件,說明了這些硫轉(zhuǎn)運蛋

47、白調(diào)控的多樣化。事實上,ATSULTR1;1更明確地被硫限制所控制。然而,ATSULTR1;2似乎由普通的代謝需求和細(xì)胞的狀態(tài)所調(diào)節(jié)45。本研究確定了GmSULTR1;2b啟動子的活性以及在根中的表達(dá)情況。該啟動子很有可能在大豆根中特異表達(dá)。GmSULTR1;2b在低硫環(huán)境中其表達(dá)量增加20,暗示GmSULTR1;2b啟動子的活性在低硫條件下其活性可能會增強(qiáng)?？梢苑蛛x出該啟動子片段,并找出其響應(yīng)低硫的核心片段,人工組建啟動子,應(yīng)用于分子育種。這樣不僅能夠使基因在特定組織表達(dá),還能在低硫條件下提高作物(尤其是大豆對硫的吸收,增加作物硫的含量。4 結(jié)論克隆了大豆GmSULTR1;2b上游2 259

48、 bp的啟動子片段,并構(gòu)建了植物表達(dá)載體pSULTR1;2bGUS。通過大豆瞬時表達(dá)證明該啟動子能夠驅(qū)動其下游GUS的表達(dá),GmSULTR1;2b啟動子主要在根毛、根表皮以及中柱中表達(dá)。References1 陸景陵. 植物營養(yǎng)學(xué)(上冊: 第二版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1994: 133-136.Lu J L. Plant Nutrition (Volume: The Second Edition. Beijing: The Agricultural University Press of China, 1994: 133-136. (in Chinese 2 Hari B K. En

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