大鼠永久性腦缺血后白細胞介素—1β表達的研究

1、    大鼠永久性腦缺血后白細胞 介素1 表達的研究        【摘要】目的研究白細胞介素1 (IL-1 )在大鼠腦缺血后的表達情況，以探討腦缺血后腦內(nèi)是否有內(nèi)源性的IL-1 產(chǎn)生，以及由何種細胞產(chǎn)生。方法采用線堵法使右側(cè)大腦中動脈永久堵塞制成大鼠局灶腦缺血模型，用免疫組化方法，顯示IL-1 在腦內(nèi)的表達。結(jié)果正常和假手術(shù)大鼠腦內(nèi)以及腦缺血后的非缺血半球未發(fā)現(xiàn)有IL-1 免疫反應(yīng)陽性細胞。腦缺血3小時后，在缺血區(qū)有散在的IL-1 陽性細胞，呈未活化的星

2、形膠質(zhì)細胞形態(tài)，隨缺血時間延長陽性星形膠質(zhì)細胞數(shù)增多，且活化程度越高，到2個月時，壞死灶周圍仍有許多IL-1 陽性、明顯活化的星形膠質(zhì)細胞。結(jié)論腦缺血后3小時至2個月，腦內(nèi)有內(nèi)源性的、蛋白水平的IL-1 產(chǎn)生，來源為星形膠質(zhì)細胞。IL-1 可能與星形膠質(zhì)細胞增生及疤痕形成有密切的關(guān)系?！娟P(guān)鍵詞】白細胞介素1 腦缺血大腦中動脈堵塞免疫組化 An immunohistochemical study of interleukin1 after permanent cerebral ischemia in ratsHuang Xusheng，Zhu Ke，Ren Ming，Tian Donghua，Z

3、hang Fengying，Liu Jiexiao（Department of Neurology, General Hospital of Chinese PLA, Beijing. 100853）【Abstract】Objective To investigate whether there are endogenously produced IL-1 protein in the brain after cerebral ischemia, if so, to further study its origin and time course of expression. MethodsA

4、n immunohistochemical method was used to detect the expression of IL-1 in the brain after a permanent focal cerebral ischemia model was made by using a monofilament nylon thread to occlude the origin of right middle cerebral artery in rat. ResultsThere are not IL-1 positive immunoreactive cells in t

5、he brain of normal and sham-operated rats and nonischemic hemisphere. Scattering distributed IL-1 positive immunoreactive astrocytes were found only in ischemic region 3 hours after ischemia, after that, the number of IL-1 positive astrocytes and the extent of its activation was increased in the isc

6、hemic hemisphere as time went on, especially the periinfarcted area. Two months after ischemia there were still much IL-1 immunoreactive positive, prominently activated astrocytes around the necrotic region. ConclusionsFrom 3 hours to 2 months after cerebral ischemia there was astrocytes produced IL

7、-1 protein in the ischemic hemisphere, and IL-1 may play a role in the process of astroglial proliferation and scar formation.【Key words】interleukin-1 cerebral ischemia middle cerebral artery occlusion immunohistochemistry目前已證實大鼠腦缺血后在缺血腦區(qū)有白細胞介素1 (IL-1 )mRNA 的表達1，在缺血早期，IL-1 可使腦損傷加重2，但所表達的IL-1 mRNA是否翻

8、譯成蛋白質(zhì)以及IL-1在腦缺血后期是否還起作用尚不明確。本研究采用永久性腦缺血模型，運用免疫組化法探討腦缺血IL-1 在腦內(nèi)的表達情況。1材料與方法1.1動物分組選用成年、雄性SD大鼠，體重250300 g，由本院實驗動物中心提供；按缺血時間分為腦缺血1、2、3、6、12、24、48、72 h,1、2、3、4、5、6、7 W，2個月及正常對照各1組，缺血組各配1假手術(shù)組，每組大鼠35只。1.2腦缺血動物模型的建立采用Longa等3建立的方法并有所改良。步驟為用10%水合氯醛麻醉動物(370 mg/kg體重)后，取頸部正中切口，暴露右頸總及頸內(nèi)、外動脈，在近心端結(jié)扎頸總動脈，在頸動脈分叉處結(jié)扎頸

9、外動脈；距頸動脈分叉0.5 cm處將頸總動脈剪一小口，插入直徑為0.165 mm的單尼龍絲，經(jīng)頸內(nèi)動脈達大腦中動脈起始部，堵塞其開口，進線長度為1720 mm，再次結(jié)扎頸總動脈，縫合切口。假手術(shù)者除不插線外其余相同。正常對照組無任何處理。1.3腦組織準備在各時間點給動物以過量水合氯醛腹腔麻醉，拔出栓塞線；經(jīng)升主動脈灌注固定，先快速灌注100 mL生理鹽水，再持續(xù)灌注4 預(yù)冷、0.1 M PB配制的4%多聚甲醛1?000 mL，灌注完畢后取腦于4后固定24小時；在0.1 M PB配制的20%蔗糖中浸泡24小時。于-15條件下在冷凍切片機上冠狀連續(xù)切片，片厚50 m，腦片入0.01 M PBS中充

10、分漂洗。1.4免疫組織化學切片依次入：含3%過氧化氫的0.01 M PBS，室溫，5 min；0.2% Triton X-100 PBS，室溫，20 min;10%正常山羊血清，室溫，10 min；小鼠抗人IL-1 抗體(1200，購于北京邦定生物醫(yī)學公司)中，4濕盒內(nèi)48 h；生物素標記的鼠抗IgG(1200)，濕盒內(nèi)室溫4 h；HRP標記的鏈霉卵白素(1200），濕盒內(nèi)室溫4 h。以上各步驟間均先用0.01 M PBS(pH 7.5)漂洗標本，室溫，10 min×3。然后DAB(0.04%)、硫酸鎳銨(3%)、葡萄糖(0.2%)、氯化胺(0.04%)及葡萄糖氧化酶(0.000?8

11、)呈色，0.1 M AB液終止染色。1%明膠貼片，自然涼干后梯度酒精脫水，二甲苯透明，DPX封片及光鏡下觀察。2結(jié)果正常和假手術(shù)大鼠腦內(nèi)以及腦缺血后的非缺血半球均未發(fā)現(xiàn)IL-1 免疫反應(yīng)陽性細胞。腦缺血3小時后的各時點，在缺血半球都有IL-1 免疫反應(yīng)陽性細胞，均呈星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)，隨缺血時間的延長，IL-1 陽性細胞數(shù)逐漸增多，活化程度逐漸增高。腦缺血3小時后，缺血區(qū)有散在的IL-1 陽性細胞，呈未活化的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)(1)；腦缺血24小時后，陽性細胞呈輕度活化的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)(2)；腦缺血2周后，IL-1 陽性細胞數(shù)明顯增多，主要位于梗死灶周圍，呈明顯活化的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)(3)；腦

12、缺血4周后，壞死灶周圍有大量IL-1 陽性、明顯活化的星形膠質(zhì)細胞，呈膠質(zhì)疤痕狀(4)；直到腦缺血后2個月，壞死灶周圍仍有大量明顯活化的IL-1 陽性星形膠質(zhì)細胞。3討論就目前研究所知，IL-1參與了腦缺血后腦水腫的形成、白細胞向缺血區(qū)的浸潤及神經(jīng)元壞死2，4，5；腦缺血后，缺血側(cè)有IL-1 mRNA的表達1；但是，起上述作用的IL-1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性還是外源性、缺血側(cè)所表達的IL-1 mRNA是否翻譯成蛋白質(zhì)、以及在腦缺血的后期IL-1是否還起作用，目前尚不明確。為此，本實驗運用免疫組化方法對大鼠永久性局灶腦缺血后IL-1 在腦內(nèi)的表達情況進行系統(tǒng)研究。本實驗在正常及假手術(shù)大鼠腦內(nèi)均未發(fā)

13、現(xiàn)有IL-1 樣免疫反應(yīng)陽性細胞，與文獻報道一致1，6，7。Sairanen等1報道大鼠全腦缺血20分鐘，再灌注2、8、24小時后，腦內(nèi)IL-1 mRNA表達明顯增加，且主要為神經(jīng)元表達，但神經(jīng)元所表達的mRNA并沒有翻譯成蛋白質(zhì)，而此時腦內(nèi)主要由星形膠質(zhì)細胞表達IL-1 蛋白質(zhì)，同時少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞和血管周圍的單核巨噬細胞亦有少量表達。目前僅該作者證實大鼠腦缺血后腦內(nèi)有IL-1 蛋白水平的表達。本研究證實在SD大鼠局灶腦缺血后3小時，缺血區(qū)即有IL-1 樣免疫反應(yīng)陽性細胞出現(xiàn)，呈未活化的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)，直到缺血后2月，在缺血半球可持續(xù)檢測到呈星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的IL-1 樣免疫反應(yīng)陽

14、性細胞，尤以壞死灶周圍明顯，且活化程度愈高。文獻報道大鼠腦缺血1小時再灌注12小時后腦組織內(nèi)方有中性粒細胞浸潤8，并且，我們用H-E染色證實大鼠局灶腦缺血后3小時，缺血半球無白細胞浸潤，因而排除了此時腦內(nèi)所表達的IL-1 來源于血源性細胞的可能性。故此，我們的結(jié)果提示腦缺血后，腦內(nèi)有內(nèi)源性的、蛋白水平的以及呈持續(xù)性的IL-1 表達。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血3小時到2月，僅在缺血半球有呈星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的IL-1 免疫反應(yīng)陽性細胞，除此外，沒有發(fā)現(xiàn)任何其它形態(tài)的陽性細胞，故此，我們認為腦缺血后腦內(nèi)IL-1 抗體，又沒有用其它特異性的細胞標記物做復(fù)染，因此亦不能除外在局灶腦缺血時，其它細胞產(chǎn)生IL-

15、1 蛋白的可能。有實驗證實腦損傷后受損腦區(qū)腦組織內(nèi)有IL-1存在，這種IL-1可以刺激星形膠質(zhì)細胞增生及促進膠質(zhì)疤痕的形成，IL-1的這種作用有可能是通過直接作用于星形膠質(zhì)細胞或是在局部刺激其它生長因子產(chǎn)生而實現(xiàn)的9。本實驗從形態(tài)學角度證實缺血性腦損傷后3小時到2個月，腦內(nèi)始終只有星形膠質(zhì)細胞表達IL-1 ，因此推測腦缺血損傷后，IL-1具有促進星形膠質(zhì)細胞增生及膠質(zhì)疤痕形成的作用，并且很可能是直接作用。Fig 1Scattering distributed IL-1 Positive immunoreactive astrocytes were found in ischemic regio

16、n 3hours after ischemia (×300)1 腦缺血3h后，缺血區(qū)有散在的星形膠質(zhì)細胞表達IL-1。×300Fig.2 There wer some sligtly activated IL-1positive immunoreactive astrocytes in ischemic area 24hours after ischemia(×300)2腦缺血24h后缺血側(cè)有輕度活化的星形膠質(zhì)細胞表達IL-1，表現(xiàn)為胞體稍肥大、突起稍增粗×300Fig.3 Many prominently activated IL-1positive

17、immunoreactive astrocytes were found in regions around the infarct two weks agter ischemia(×300)3腦缺血2周后梗塞灶周圍IL-1陽性星形膠質(zhì)細胞明顯活化，胞體肥大、突起增粗×300Fig.4 There were abundant highly activated IL-1positive immunoreactive astrocytes around the necrotic region and in the form of astroglial formation fou

18、r weeks after ischemia(×300)4腦缺血4周后，壞死灶周圍有大量IL-1陽性、明顯活化的星形膠質(zhì)細胞×300(責任編輯：林平)黃旭升（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）朱克（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）任明（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）田東華（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）張鳳英（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）劉潔曉（解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科100853）參考文獻1，Sairanen TR, Lindsbery PJ, Brenner M, et al. Global forebrain ischemia results in dif

19、ferential cellular expression of interleukin-1 (IL-1 ) and its receptor at mRNA and protein level. J Cereb Blood Flow Metab, 1997,17(10):11072，Schielke GP, Yang GY. Shivers BD, et al. Reduced ischemic brain injury in interleukin-1 converting enzyme-deficient mice. J Cereb Blood Flow Metab, 1998,18(2

20、):1803，Longa EZ, Weinstein PR, Carlson s, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat. Stroke, 1989,20(1):844，Yamasaki Y, Matsuura N, Shozuhara H, et al. Interleukin-1as a pathogenetic mediator of ischemic brain damage in rats. Stroke,1995,26(4):6765，Stroemer RP and Rothwell NJ. Corticol protection by localized striatal injection of IL-1 ra