抗人CD25分子單鏈抗體基因的構建、 表達及初步鑒定

1、抗人CD25分子單鏈抗體基因的構建、 表達及初步鑒定摘nbsp;要nbsp;nbsp;目的:nbsp;構建和表達抗人CD25分子單鏈抗體（scFv）蛋白,nbsp;nbsp;并測定其生物學活性。方法:nbsp;用RTPCR方法從能分泌特異性抗CD25單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細胞中分離純化抗體VH和VL基 Construction, expression and identification of a single chain antibody variable (scFv) against human CD25 molecule SHEN Tao, ZHANG Aihua*, BI Lan

2、, SHI Liangru Department of Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035; Department of Immunology and Monoclonal Antibodies R&D Laboratory, Wuhan Biological Products Institute, Wuhan 430060, China Abstract AIM: To construct and express a single chain fragment variable (scFv)

3、 fragment against human CD25 molecule and identify its bioactivity. METHODS: VH and VL genes of antimurine CD25 monoclonal antibody were cloned by RTPCR from hybridoma cell WuTac secreting antiCD25 mAb. scFv gene was spliced by sequence overlap extending (SOE) PCR, and then it was ligated into pMD18

4、T vector to be identified by endonuclease digestion, PCR and sequencing. scFv gene was cloned into pBAD/gIIIA expression vector and transformed into TOP10 E.coli. After positive clones were induced by Larabinose for 4 hours, the purity of protein was detected by SDSPAGE and its bioactivity was ident

5、ified by competitive inhibition ELISA test. RESULTS: scFv genes of VL(GGGGSGGGGSSGGGS)VH was constructed successfully. The VH chain consisted of 351 bp and encoded 117 amino acids, which belonged to heavy chain subgroup III (C) of mouse immunoglobulin variable region. The VL chain consisted of 318 b

6、p and encoded 106 amino acids, which belonged to light chain subgroup IV of mouse immunoglobulin variable region. The scFv antibody expressed by TOP10 fused with 6His and Cmyc tag protein and the relative molecular mass of fusion protein was about 31 000. Competitive inhibition ELISA test indicated

7、the scFv antibody had specific activity. CONCLUSION: The expressed product of the singlechain antibody shows some specific binding capacity, which provides a basis for the clinical application of antiCD25 singlechain antibody. KeywordsCD25; scFv; protein expression; ELISA 摘 要 目的: 構建和表達抗人CD25分子單鏈抗體（s

8、cFv）蛋白, 并測定其生物學活性。方法: 用RTPCR方法從能分泌特異性抗CD25單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細胞中分離純化抗體VH和VL基因。用重疊延伸PCR方法將VH和VL拼接在一起, 構建抗CD25分子scFv的基因。將scFv基因克隆至pMD18T, 用限制性內(nèi)切酶切以及測序鑒定。將scFv 基因連接到pBAD/gA表達載體, 轉化Top10表達菌。陽性克隆用左旋阿拉伯糖誘導4 h, SDSPAGE電泳檢測蛋白純度, 競爭抑制ELISA實驗檢測其活性。結果: scFv基因長度約為700 bp。通過DNA序列測定和分析, 構建出VL(GGGGS)3VH（但其中349位G突變?yōu)锳, 使L

9、inker其中一位GlySer）。其VH隸屬于小鼠Ig重鏈可變區(qū)（C）亞類, 全長351 bp, 可編碼117個氨基酸; 其VL隸屬于小鼠Ig輕鏈可變區(qū)亞類, 全長318 bp, 可編碼106個氨基酸。TOP10中表達的scFv抗體加上同時融合表達的兩個標簽6His和Cmyc Mr約為31 000, 結果符合scFv的Mr。競爭抑制細胞ELISA實驗顯示表達的scFv具有活性。結論: 此scFv基因的表達產(chǎn)物具有一定的特異結合活性。為抗CD25 scFv的臨床應用打下了基礎。 關鍵詞CD25; scFv; 蛋白表達; ELISA CD25是白介素2受體（IL2R）的亞單位1?？笴D25抗體能抑

10、制IL2與受體結合, 阻止依賴IL2的生物反應, 抑制其促使T淋巴細胞進入有絲分裂期進行克隆擴增的作用, 有明顯的免疫抑制和調(diào)節(jié)作用, 在器官移植和腫瘤治療中應用廣泛2。其鼠源性單克隆抗體（mAb）已在臨床上取得了良好的療效, 但由于其相對分子質(zhì)量（Mr）較大及其鼠源性, 在臨床應用被大大限制。本研究中應用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術, 直接從一株分泌抗CD25 mAb的雜交瘤細胞WuTac中擴增出輕鏈及重鏈可變區(qū)的基因序列并采用拼接重疊延伸PCR (splicing by overlap extension PCR)即SOEPCR的方法構建了WuTacscFv基因, 并進行了序列測定

11、和分析, 得到了VL(GGGGS)3VH(其中349位G突變?yōu)锳, 使Linker其中一位GlySer)的scFv基因。將陽性重組質(zhì)粒轉化大腸桿菌進行分泌性表達, 獲得了具有一定活性的scFv蛋白。 1 材料和方法 1.1 材料 分泌抗人CD25 mAb（IgG1）的雜交瘤細胞系WuTac3, 本室保存。為免疫球蛋白亞型。E.coli XL1Blue購自Promega公司; E.coli TOP10購自Invitrogen公司; 克隆載體pMD18T系統(tǒng)購自TAKARA公司; 表達載體pBAD/gIIIA購自Invitrogen公司。Trizol Reagent購自Invitrogen公司;

12、SuperScriptTM Firststrand synthesis system for RTPCR Kit購自GIBCO BRL公司; Taq DNA聚合酶購自MBI公司; T4 DNA連接酶和購限制性內(nèi)切酶購自Promega公司; 200 g/L左旋阿拉伯糖(Larabinose) 購于Invitrogen公司; 鼠抗His抗體購于Pharmacia biotech公司; 羊抗鼠IgGHRP購于Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 VH和VL引物設計 參照文獻4和Blast數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計資料, 以及所選Linker (GGGGS)3的核苷酸編碼序列, 設計并合成4條寡聚核苷酸引物。

13、在VL和VH引物中分別引入Nco I和Xba I限制性內(nèi)切酶的識別序列, 其中R=A/G, M=A/C, S=C/G, W=A/T, Y=C/T, K=G/T。VLback: 5CAGATGCCATGGCGATTGTKCTSACYCARTCTCCA3; VLforward: 5CGAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCCTCCTTTCAGCTCCAGCTT3; VHback: 5GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGTCCAGCTCCAGCAG3; VHforward: 5GACGGT TCTAGATGGGAGACGGTGACTGAGGTT3。 1.2.2 V

14、H和VL的提取及scFv基因的構建 復蘇WuTac細胞, 參照Trizol Reagent kit的說明書, 一步法提取WuTac細胞總mRNA。參照SuperScriptTM RTPCR逆轉錄試劑盒說明書, 逆轉錄獲得cDNA, 再以cDNA為模板, PCR擴增出抗CD25 mAb的輕重鏈基因。采用重疊延伸拼接法(splicing by overlapping extension, SOE) 將輕重鏈基因連接成單鏈基因, 具體過程如下: 首先將純化后的輕重鏈基因混勻, 在無外加引物的情況下, 互為引物和模板, PCR反應(94 30 s, 58 30 s, 72 60 s)擴增7個循環(huán), 隨

15、后在反應體系中補加VLback和VHforward, 同樣的PCR反應條件擴增30個循環(huán)。最終將所得PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18T連接后酶切測序鑒定。 1.2.3 scFv的表達 將重組克隆載體和原核表達載體pBAD/gIIIA用Nco I和Xba I分別雙酶切后連接成重組表達載體。參照表達載體說明書, 以2YT為培養(yǎng)基, 用不同濃度的Larabinose (20%0.002%) 在37誘導表達, 根據(jù)產(chǎn)物產(chǎn)量確定最佳濃度為20 g/L, 誘導時間為4 h。 1.2.4 細胞ELISA活性檢測 制備外周血單個核細胞(PBMC)懸液, 用尼龍棉柱法去除B細胞, 用無血清的RPMI1640洗滌3

16、次后調(diào)整密度為1109/L, 96孔細胞反應板中加入含20 mL/L FCS的RPMI1640 20 L, PHA（250 g/L） 20 L, 然后每孔加入上述細胞懸液100 L, 置于37, 50 mL/L CO2條件培養(yǎng)48 h; 將培養(yǎng)細胞稀釋至5107/L, 接種至96孔細胞培養(yǎng)板, 37培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液, 冷丙酮固定10 min, 棄去丙酮; 每孔加阻斷劑100 L (10 mL PBS+100 L 300 mL/L H2O2), 室溫保持30 min, PBS洗滌3次, 每次5 min; 將上述純化的鼠源scFv分泌產(chǎn)物作5倍梯度稀釋, 空表達載體轉化的E.coli. p

17、BAD/gIIIA TOP10經(jīng)上述同樣的誘導表達產(chǎn)物作陰性對照; 加新鮮配制的封閉液200 L/孔, 37, 2 h; PBS洗滌3次, 每次5 min; 加入已稀釋的scFv上清100 L/孔, 混勻, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加一抗(anti6His antibody ) (用新鮮配制的封閉液稀釋至15 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 每次5 min; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鮮配制的封閉液稀釋至11 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加新鮮配制的底物H2

18、O2/OPD, 室溫避光30 min; 加2 mol/L H2SO4終止反應后測定A492值。 1.2.5 競爭抑制細胞ELISA 鼠源scFv分泌產(chǎn)物作5倍梯度稀釋, 100 L/孔。同時加WuTac雜交瘤細胞培養(yǎng)小鼠腹水3倍稀釋液100 L/孔。空表達載體轉化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10經(jīng)上述同樣的誘導表達產(chǎn)物作陰性對照; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鮮配制的封閉液稀釋至11 000) 100 L/孔, 其余步驟同同1.2.4。 2 結果 2.1 抗CD25 scFv基因的構建和陽性表達載體的鑒定 從WuTac雜交瘤細胞中提取的總RNA經(jīng)RTPCR的cDNA為模

19、板擴增出輕重鏈基因, 再利用設計在引物兩側的重疊片段進行SOEPCR反應, 獲得Mr長約700 bp左右的基因片段。將其與pMD18T連接后, 轉化E.coli XL1Blue, PCR鑒定后, 再雙酶切和T4酶連接, 將scFv片段連接到表達載體pBAD/g/A上, 轉化后Nco I和Xba I雙酶切鑒定。如圖1所示, 其中1#、 2#、 6#克隆含有目的片段。 圖1 WuTacscFvpBAD/gIII/A表達載體酶切分析（略） Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids 1: DNA marker

20、; 2-4: Recombinant plasmid 1#, 2# and 3#; 5: DNA marker; 6-8: Recombinant plasmid 4#, 5# and 6#; 9: DNA marker. 2.2 抗CD25 scFv基因序列分析和鑒定 將上述1#、 2#、 6#克隆序列測定, 結果顯示1#、 2#克隆序列為陽性克隆。但其linker為GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。原因是由于其中349位G突變?yōu)锳, 使Linker其中第11位GlySer。但中間無終止密碼出現(xiàn)。將此種scFv稱為抗CD25scFv。

21、1#、 2#克隆序列完全一致, 經(jīng)與BLAST和Kabat基因數(shù)據(jù)庫查詢確定其VH隸屬于小鼠Ig重鏈可變區(qū)（C）亞類, 全長351 bp, 可編碼117個氨基酸; 其VL隸屬于小鼠Ig輕鏈可變區(qū)亞類, 全長318 bp, 可編碼106個氨基酸。 2.3 抗CD25 scFv基因表達分析 將1#克隆陽性轉化菌進行誘導表達, SDSPAGE及Western blot檢測表達的融合蛋白。Mr為31 000左右。結果見圖2、 3。 圖2 阿拉伯糖誘導表達產(chǎn)物的SDSPAGE結果（略） Fig 2 The SDSPAGE results of expressing products induced by

22、 Larabinose 1: Protein marker; 2, 4: Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively; 3: Negative E.coli TOP10 induced by Larabinose; 5: Positive E.coli TOP 10 not induced by Larabinose. 圖3 重組蛋白的Western blot分析（略） Fig 3 Western blot analysis of recombinant protein 1: Prestained marker; 2: Ce

23、ll control; 3, 4; Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively. 2.4 抗CD25 scFv基因表達產(chǎn)物特異性檢測 細胞ELISA檢測表達產(chǎn)物與絲裂原活化的T細胞的結合, 測定A492。空表達載體轉化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10經(jīng)上述同樣的誘導表達的產(chǎn)物作陰性對照?？笴D25scFv對WuTac的競爭抑制分析結果表明 陽性轉化菌上清表達產(chǎn)物與CD25抗原有一定的結合能力, 改造后的scFv仍保持著其親本抗體的特異性和結合活性（圖4、 5）。 圖4 鼠源性抗CD25scFv與活化T細胞結合

24、能力檢測（略） Fig 4 Analysis of the binding ability between scFv and activiated T cells 圖5 鼠源性抗CD25scFv對親本抗體WuTac的競爭抑制分析（略） Fig 5 Analysis of the binding competition inhibition by the scFv and WuTac 3 討論 IL2與IL2R相互作用是一個藥物干涉達到免疫抑制很重要的靶目標1, 5。鼠源抗Tac及其他IL2R抗體能抑制IL2與受體的結合, 阻止依賴IL2的生物反應。在人類能預防腎臟、 心臟、 皮膚、 胰腺同種異

25、體移植后的急性排斥反應, 延長器官移植后的生存時間, 甚至還有抑制遲發(fā)性超敏反應的作用。但鼠源性mAb 對人體來說是一種異種蛋白, 在人體內(nèi)多次應用后, 可誘導產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA）和過敏反應等副作用, 并影響其治療效果, 從而阻礙了其應用范圍, 使其應用受到限制。本實驗中, 一方面由于時間和條件的限制, 沒有對表達產(chǎn)物進行親和層析純化(利用6His標簽可與鎳離子結合), 同時也考慮到在純化的過程中會丟失大量的目的蛋白, 對其活性也會有不同程度的影響。另一方面由于缺乏純化的CD25抗原, 對scFv的活性檢測增加了難度。利用活化的T細胞作為抗原進行細胞ELISA能在一定程度上證明所分泌的抗體具有與CD25抗原結合的活性。我們利用一抗(鼠抗6His)和二抗(羊抗鼠IgGHRP)做間接細胞ELISA對分泌產(chǎn)物的活性進行了初步分析, 為進一步對scFv的大量表達和大量提取、 純化、 活性鑒定以及免疫毒素的構建打下了良好的基礎。 參考文獻: 1 Baan CC, van der Mast B