抗人CD25分子單鏈抗體基因的構(gòu)建、 表達(dá)及初步鑒定

1、抗人CD25分子單鏈抗體基因的構(gòu)建、 表達(dá)及初步鑒定摘nbsp;要nbsp;nbsp;目的:nbsp;構(gòu)建和表達(dá)抗人CD25分子單鏈抗體（scFv）蛋白,nbsp;nbsp;并測(cè)定其生物學(xué)活性。方法:nbsp;用RTPCR方法從能分泌特異性抗CD25單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細(xì)胞中分離純化抗體VH和VL基 Construction, expression and identification of a single chain antibody variable (scFv) against human CD25 molecule SHEN Tao, ZHANG Aihua*, BI Lan

2、, SHI Liangru Department of Microbiology and Immunology, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035; Department of Immunology and Monoclonal Antibodies R&D Laboratory, Wuhan Biological Products Institute, Wuhan 430060, China Abstract AIM: To construct and express a single chain fragment variable (scFv)

3、 fragment against human CD25 molecule and identify its bioactivity. METHODS: VH and VL genes of antimurine CD25 monoclonal antibody were cloned by RTPCR from hybridoma cell WuTac secreting antiCD25 mAb. scFv gene was spliced by sequence overlap extending (SOE) PCR, and then it was ligated into pMD18

4、T vector to be identified by endonuclease digestion, PCR and sequencing. scFv gene was cloned into pBAD/gIIIA expression vector and transformed into TOP10 E.coli. After positive clones were induced by Larabinose for 4 hours, the purity of protein was detected by SDSPAGE and its bioactivity was ident

5、ified by competitive inhibition ELISA test. RESULTS: scFv genes of VL(GGGGSGGGGSSGGGS)VH was constructed successfully. The VH chain consisted of 351 bp and encoded 117 amino acids, which belonged to heavy chain subgroup III (C) of mouse immunoglobulin variable region. The VL chain consisted of 318 b

6、p and encoded 106 amino acids, which belonged to light chain subgroup IV of mouse immunoglobulin variable region. The scFv antibody expressed by TOP10 fused with 6His and Cmyc tag protein and the relative molecular mass of fusion protein was about 31 000. Competitive inhibition ELISA test indicated

7、the scFv antibody had specific activity. CONCLUSION: The expressed product of the singlechain antibody shows some specific binding capacity, which provides a basis for the clinical application of antiCD25 singlechain antibody. KeywordsCD25; scFv; protein expression; ELISA 摘 要 目的: 構(gòu)建和表達(dá)抗人CD25分子單鏈抗體（s

8、cFv）蛋白, 并測(cè)定其生物學(xué)活性。方法: 用RTPCR方法從能分泌特異性抗CD25單克隆抗體（mAb）的雜交瘤細(xì)胞中分離純化抗體VH和VL基因。用重疊延伸PCR方法將VH和VL拼接在一起, 構(gòu)建抗CD25分子scFv的基因。將scFv基因克隆至pMD18T, 用限制性內(nèi)切酶切以及測(cè)序鑒定。將scFv 基因連接到pBAD/gA表達(dá)載體, 轉(zhuǎn)化Top10表達(dá)菌。陽(yáng)性克隆用左旋阿拉伯糖誘導(dǎo)4 h, SDSPAGE電泳檢測(cè)蛋白純度, 競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活性。結(jié)果: scFv基因長(zhǎng)度約為700 bp。通過(guò)DNA序列測(cè)定和分析, 構(gòu)建出VL(GGGGS)3VH（但其中349位G突變?yōu)锳, 使L

9、inker其中一位GlySer）。其VH隸屬于小鼠Ig重鏈可變區(qū)（C）亞類, 全長(zhǎng)351 bp, 可編碼117個(gè)氨基酸; 其VL隸屬于小鼠Ig輕鏈可變區(qū)亞類, 全長(zhǎng)318 bp, 可編碼106個(gè)氨基酸。TOP10中表達(dá)的scFv抗體加上同時(shí)融合表達(dá)的兩個(gè)標(biāo)簽6His和Cmyc Mr約為31 000, 結(jié)果符合scFv的Mr。競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)顯示表達(dá)的scFv具有活性。結(jié)論: 此scFv基因的表達(dá)產(chǎn)物具有一定的特異結(jié)合活性。為抗CD25 scFv的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞CD25; scFv; 蛋白表達(dá); ELISA CD25是白介素2受體（IL2R）的亞單位1?？笴D25抗體能抑

10、制IL2與受體結(jié)合, 阻止依賴IL2的生物反應(yīng), 抑制其促使T淋巴細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期進(jìn)行克隆擴(kuò)增的作用, 有明顯的免疫抑制和調(diào)節(jié)作用, 在器官移植和腫瘤治療中應(yīng)用廣泛2。其鼠源性單克隆抗體（mAb）已在臨床上取得了良好的療效, 但由于其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）較大及其鼠源性, 在臨床應(yīng)用被大大限制。本研究中應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù), 直接從一株分泌抗CD25 mAb的雜交瘤細(xì)胞WuTac中擴(kuò)增出輕鏈及重鏈可變區(qū)的基因序列并采用拼接重疊延伸PCR (splicing by overlap extension PCR)即SOEPCR的方法構(gòu)建了WuTacscFv基因, 并進(jìn)行了序列測(cè)定

11、和分析, 得到了VL(GGGGS)3VH(其中349位G突變?yōu)锳, 使Linker其中一位GlySer)的scFv基因。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行分泌性表達(dá), 獲得了具有一定活性的scFv蛋白。 1 材料和方法 1.1 材料 分泌抗人CD25 mAb（IgG1）的雜交瘤細(xì)胞系WuTac3, 本室保存。為免疫球蛋白亞型。E.coli XL1Blue購(gòu)自Promega公司; E.coli TOP10購(gòu)自Invitrogen公司; 克隆載體pMD18T系統(tǒng)購(gòu)自TAKARA公司; 表達(dá)載體pBAD/gIIIA購(gòu)自Invitrogen公司。Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司;

12、SuperScriptTM Firststrand synthesis system for RTPCR Kit購(gòu)自GIBCO BRL公司; Taq DNA聚合酶購(gòu)自MBI公司; T4 DNA連接酶和購(gòu)限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司; 200 g/L左旋阿拉伯糖(Larabinose) 購(gòu)于Invitrogen公司; 鼠抗His抗體購(gòu)于Pharmacia biotech公司; 羊抗鼠IgGHRP購(gòu)于Sigma公司。 1.2 方法 1.2.1 VH和VL引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)4和Blast數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)資料, 以及所選Linker (GGGGS)3的核苷酸編碼序列, 設(shè)計(jì)并合成4條寡聚核苷酸引物。

13、在VL和VH引物中分別引入Nco I和Xba I限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列, 其中R=A/G, M=A/C, S=C/G, W=A/T, Y=C/T, K=G/T。VLback: 5CAGATGCCATGGCGATTGTKCTSACYCARTCTCCA3; VLforward: 5CGAGCCGCCACCGCCCGAGCCACCGCCTCCTTTCAGCTCCAGCTT3; VHback: 5GGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCTGTCCAGCTCCAGCAG3; VHforward: 5GACGGT TCTAGATGGGAGACGGTGACTGAGGTT3。 1.2.2 V

14、H和VL的提取及scFv基因的構(gòu)建 復(fù)蘇WuTac細(xì)胞, 參照Trizol Reagent kit的說(shuō)明書, 一步法提取WuTac細(xì)胞總mRNA。參照SuperScriptTM RTPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書, 逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 再以cDNA為模板, PCR擴(kuò)增出抗CD25 mAb的輕重鏈基因。采用重疊延伸拼接法(splicing by overlapping extension, SOE) 將輕重鏈基因連接成單鏈基因, 具體過(guò)程如下: 首先將純化后的輕重鏈基因混勻, 在無(wú)外加引物的情況下, 互為引物和模板, PCR反應(yīng)(94 30 s, 58 30 s, 72 60 s)擴(kuò)增7個(gè)循環(huán), 隨

15、后在反應(yīng)體系中補(bǔ)加VLback和VHforward, 同樣的PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。最終將所得PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18T連接后酶切測(cè)序鑒定。 1.2.3 scFv的表達(dá) 將重組克隆載體和原核表達(dá)載體pBAD/gIIIA用Nco I和Xba I分別雙酶切后連接成重組表達(dá)載體。參照表達(dá)載體說(shuō)明書, 以2YT為培養(yǎng)基, 用不同濃度的Larabinose (20%0.002%) 在37誘導(dǎo)表達(dá), 根據(jù)產(chǎn)物產(chǎn)量確定最佳濃度為20 g/L, 誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。 1.2.4 細(xì)胞ELISA活性檢測(cè) 制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液, 用尼龍棉柱法去除B細(xì)胞, 用無(wú)血清的RPMI1640洗滌3

16、次后調(diào)整密度為1109/L, 96孔細(xì)胞反應(yīng)板中加入含20 mL/L FCS的RPMI1640 20 L, PHA（250 g/L） 20 L, 然后每孔加入上述細(xì)胞懸液100 L, 置于37, 50 mL/L CO2條件培養(yǎng)48 h; 將培養(yǎng)細(xì)胞稀釋至5107/L, 接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 37培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液, 冷丙酮固定10 min, 棄去丙酮; 每孔加阻斷劑100 L (10 mL PBS+100 L 300 mL/L H2O2), 室溫保持30 min, PBS洗滌3次, 每次5 min; 將上述純化的鼠源scFv分泌產(chǎn)物作5倍梯度稀釋, 空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli. p

17、BAD/gIIIA TOP10經(jīng)上述同樣的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作陰性對(duì)照; 加新鮮配制的封閉液200 L/孔, 37, 2 h; PBS洗滌3次, 每次5 min; 加入已稀釋的scFv上清100 L/孔, 混勻, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加一抗(anti6His antibody ) (用新鮮配制的封閉液稀釋至15 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 每次5 min; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鮮配制的封閉液稀釋至11 000) 100 L/孔, 37, 2 h; 用PBST和PBS先后各洗3次, 加新鮮配制的底物H2

18、O2/OPD, 室溫避光30 min; 加2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后測(cè)定A492值。 1.2.5 競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)胞ELISA 鼠源scFv分泌產(chǎn)物作5倍梯度稀釋, 100 L/孔。同時(shí)加WuTac雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)小鼠腹水3倍稀釋液100 L/孔?？毡磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10經(jīng)上述同樣的誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物作陰性對(duì)照; 加二抗(羊抗鼠IgGHRP) (用新鮮配制的封閉液稀釋至11 000) 100 L/孔, 其余步驟同同1.2.4。 2 結(jié)果 2.1 抗CD25 scFv基因的構(gòu)建和陽(yáng)性表達(dá)載體的鑒定 從WuTac雜交瘤細(xì)胞中提取的總RNA經(jīng)RTPCR的cDNA為模

19、板擴(kuò)增出輕重鏈基因, 再利用設(shè)計(jì)在引物兩側(cè)的重疊片段進(jìn)行SOEPCR反應(yīng), 獲得Mr長(zhǎng)約700 bp左右的基因片段。將其與pMD18T連接后, 轉(zhuǎn)化E.coli XL1Blue, PCR鑒定后, 再雙酶切和T4酶連接, 將scFv片段連接到表達(dá)載體pBAD/g/A上, 轉(zhuǎn)化后Nco I和Xba I雙酶切鑒定。如圖1所示, 其中1#、 2#、 6#克隆含有目的片段。 圖1 WuTacscFvpBAD/gIII/A表達(dá)載體酶切分析（略） Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmids 1: DNA marker

20、; 2-4: Recombinant plasmid 1#, 2# and 3#; 5: DNA marker; 6-8: Recombinant plasmid 4#, 5# and 6#; 9: DNA marker. 2.2 抗CD25 scFv基因序列分析和鑒定 將上述1#、 2#、 6#克隆序列測(cè)定, 結(jié)果顯示1#、 2#克隆序列為陽(yáng)性克隆。但其linker為GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。原因是由于其中349位G突變?yōu)锳, 使Linker其中第11位GlySer。但中間無(wú)終止密碼出現(xiàn)。將此種scFv稱為抗CD25scFv。

21、1#、 2#克隆序列完全一致, 經(jīng)與BLAST和Kabat基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢確定其VH隸屬于小鼠Ig重鏈可變區(qū)（C）亞類, 全長(zhǎng)351 bp, 可編碼117個(gè)氨基酸; 其VL隸屬于小鼠Ig輕鏈可變區(qū)亞類, 全長(zhǎng)318 bp, 可編碼106個(gè)氨基酸。 2.3 抗CD25 scFv基因表達(dá)分析 將1#克隆陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), SDSPAGE及Western blot檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白。Mr為31 000左右。結(jié)果見圖2、 3。 圖2 阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE結(jié)果（略） Fig 2 The SDSPAGE results of expressing products induced by

22、 Larabinose 1: Protein marker; 2, 4: Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively; 3: Negative E.coli TOP10 induced by Larabinose; 5: Positive E.coli TOP 10 not induced by Larabinose. 圖3 重組蛋白的Western blot分析（略） Fig 3 Western blot analysis of recombinant protein 1: Prestained marker; 2: Ce

23、ll control; 3, 4; Positive E.coli TOP10 induced by Larabinose respectively. 2.4 抗CD25 scFv基因表達(dá)產(chǎn)物特異性檢測(cè) 細(xì)胞ELISA檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物與絲裂原活化的T細(xì)胞的結(jié)合, 測(cè)定A492?？毡磉_(dá)載體轉(zhuǎn)化的E.coli. pBAD/gIIIATOP10經(jīng)上述同樣的誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物作陰性對(duì)照?？笴D25scFv對(duì)WuTac的競(jìng)爭(zhēng)抑制分析結(jié)果表明 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌上清表達(dá)產(chǎn)物與CD25抗原有一定的結(jié)合能力, 改造后的scFv仍保持著其親本抗體的特異性和結(jié)合活性（圖4、 5）。 圖4 鼠源性抗CD25scFv與活化T細(xì)胞結(jié)合

24、能力檢測(cè)（略） Fig 4 Analysis of the binding ability between scFv and activiated T cells 圖5 鼠源性抗CD25scFv對(duì)親本抗體WuTac的競(jìng)爭(zhēng)抑制分析（略） Fig 5 Analysis of the binding competition inhibition by the scFv and WuTac 3 討論 IL2與IL2R相互作用是一個(gè)藥物干涉達(dá)到免疫抑制很重要的靶目標(biāo)1, 5。鼠源抗Tac及其他IL2R抗體能抑制IL2與受體的結(jié)合, 阻止依賴IL2的生物反應(yīng)。在人類能預(yù)防腎臟、 心臟、 皮膚、 胰腺同種異

25、體移植后的急性排斥反應(yīng), 延長(zhǎng)器官移植后的生存時(shí)間, 甚至還有抑制遲發(fā)性超敏反應(yīng)的作用。但鼠源性mAb 對(duì)人體來(lái)說(shuō)是一種異種蛋白, 在人體內(nèi)多次應(yīng)用后, 可誘導(dǎo)產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA）和過(guò)敏反應(yīng)等副作用, 并影響其治療效果, 從而阻礙了其應(yīng)用范圍, 使其應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)中, 一方面由于時(shí)間和條件的限制, 沒(méi)有對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行親和層析純化(利用6His標(biāo)簽可與鎳離子結(jié)合), 同時(shí)也考慮到在純化的過(guò)程中會(huì)丟失大量的目的蛋白, 對(duì)其活性也會(huì)有不同程度的影響。另一方面由于缺乏純化的CD25抗原, 對(duì)scFv的活性檢測(cè)增加了難度。利用活化的T細(xì)胞作為抗原進(jìn)行細(xì)胞ELISA能在一定程度上證明所分泌的抗體具有與CD25抗原結(jié)合的活性。我們利用一抗(鼠抗6His)和二抗(羊抗鼠IgGHRP)做間接細(xì)胞ELISA對(duì)分泌產(chǎn)物的活性進(jìn)行了初步分析, 為進(jìn)一步對(duì)scFv的大量表達(dá)和大量提取、 純化、 活性鑒定以及免疫毒素的構(gòu)建打下了良好的基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn): 1 Baan CC, van der Mast B