微衛(wèi)星DNA標記對5個中外黃牛品種_群體遺傳結構的研究

1、吉林農業(yè)大學學報2000,22(4):510JournalofJilinAgriculturalUniversity微衛(wèi)星DNA標記對5個中外黃牛品種/群體遺傳結構的研究吳偉1王棟1曹紅鶴2(1.吉林農業(yè)大學動物科技學院長春130118;2.100094)摘要:利用4種微衛(wèi)星DNA、×南陽牛雜種5個品種/,在此基礎上又進行了聚類分析。關鍵詞:DNA;黃牛;遺傳結構中圖分類號:S823.8文獻標識碼:A文章編號:100025684(2000)0420005206GeneticStructureofFiveChineseandForeignCattleBreedsUsingMicrosa

2、telliteDNAMarkersWUWei1,WANGDong1,CAOHong2he2(1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofAnimalHusbandry,AgriculturalScienceAcademyofChina,Beijing100094,China)Abstract:Geneticstructureincludinggenefrequency,heterozygosity(H),polymorphisminfor

3、2mationcontents(PIC),numbersofeffectivealleles(Ne)andgeneticdistanceswerestudiedinfivecattlebreeds,namelyNanyang,Yanbian,Hanwoo,SimmentalandPiemontese×Nanyang,usingfourmicrosatelliteDNAmarkers.Clusteranalysiswasconductedbasedonmicrosatellitepolymorphism.GeneticrelationshipsbetweenChineseandfore

4、igncattleandbetweenBosandcommonbreedswerestatedatmolecularbiotechniquelevel.Keywords:microsatelliteDNA;marker;cattle;geneticstructure近年來,由于國內一些地方過度追求肉牛的經濟效益,盲目引進高度培育的品種濫用雜交,使國內黃牛品種的數量日趨減少以至于瀕臨消亡,許多寶貴的基因也將隨之丟失。任何一個品種都是一座寶貴的基因庫,對國內外黃牛品種資源進行調查、研究、保護及合理利用已是一項刻不容緩的工作。當前分子生物技術的飛速發(fā)展,為品種資源多樣性的研究和保護提供了最好的契機。

5、遺傳標記技術為品種多樣性的研究做出了很大貢獻。如Medjugorac5用生化多態(tài)性標記分析歐洲14個牛品種的遺傳結構,Peelman6和Martin7用微衛(wèi)星標記法對國外不同牛品種進行了遺傳分析。國內學者曹紅鶴等1,2用蛋白質多態(tài)性作為遺傳標記,對國內20余個黃牛品種進行了遺傳結基金項目:“九五”農業(yè)部重點科研計劃資助項目作者簡介:吳偉,男,1950年出生,碩士,副教授,研究方向:動物遺傳育種收稿日期:2000208220© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserve

6、d. 6吉林農業(yè)大學學報2000年構分析,比較了中國黃牛與周邊國家黃牛品種的異同。目前國內采用更精確的分子遺傳標記微衛(wèi)星DNA標記,對中國黃牛與外國黃牛的遺傳關系的研究尚未見報道。本文利用微衛(wèi)星DNA作為遺傳標記,研究中外5個黃牛品種的遺傳結構,旨在從分子水平上探討中國黃牛與外國黃牛、瘤牛與普通牛的遺傳多態(tài)性,為黃牛品種資源的深入研究及保存和利用提供重要依據。dNTP、TEMED、BindingSalution、Sigmalote、100bpLadderDNA,4種微衛(wèi)星DNA引物(見表1)由意大利國家研究委員會(CNR)和動物種質資源保存利用研究所(IDVGA)實驗室提供。112方法1121

7、1基因組DNA的提取方法具體方法參1材料與方法111材料11111試驗牛品種本試驗共采集了延邊牛、南見文獻3。11212基因組DNA濃度及純度檢測以DNA/EcoR+Hind作分子量標記,用018%瓊脂糖凝膠電泳分析,經EBDNA、,來陽牛、西門塔爾牛、韓牛、皮埃蒙特牛×種5個品種/群體的血樣11112酶K、甲叉胺分子量標記物(EcoR+Hind)、限制性內切酶Hap、CNR、IDV24DNA引物,并利用他們提供的Cosmid克隆的PCR產物做標準,來判斷等位基因的大小。4種微衛(wèi)星DNA引物PCR反應條件見表1。表14種微衛(wèi)星DNA引物及PCR反應條件Table1.Thedataof

8、fourmicrosatellitesandconditionsofPCR微衛(wèi)星DNA引物重復單位Repeat產物/bpProductsMicrosatellite引物序列)Primer(53CCTTCTGGCAACCACCTATTTGTCCACCTAAGTGTCTCCTGATGGATGGTCAGTCACAGAGAAGCACAGGAAAGCCTGGTACTCATGGAATAGGGAGAATGGATGGAACCAAATTTCGAAGACGGGCAGACAGGAAATCCTTTCAAGTATGTTTTCAACTCACTCCAGTATTCTTGTCTGMg2+濃度染色體位置(/nmolL-1)Loc

9、ality.退火溫度t/AnnealingtemperatureMg2+concentration115IDVGA-11(AC)192308q1460IDVGA-27(AC)101383q3711560IDVGA-44(AC)1921119q2211060IDVGA-46(AC)1120519q1611550PCR擴增程序:94預變性3min94變性30s退火45s72延伸45s,共35個循環(huán),反應結束后72延伸10min。擴增產物的電泳及染色:先用115%瓊脂糖凝膠檢查PCR擴增效果,將擴增效果好的再用7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進一步分析。電泳:向PCR擴增產物中加入4Lstoploadin

10、gDye,95變性3min。關閉電源,加樣4L,用電泳儀(1700V,50W電泳2215h。染色:參照曹紅鶴4方法進行。11214數據的統(tǒng)計分析采用PHLIP軟件計算了遺傳距離、平均雜合度并聚類,另用DISPAN軟件再次進行了聚類分析,用QBASIC程序計算了每個位點的群體雜合度、有效等位基因數和多態(tài)信息含量,公式略。2結果與分析211基因組DNA提取從凍血中提取的DNA用018%瓊脂糖凝膠電泳分析,然后在紫外燈下觀察,結果見圖1。圖中M代表Marker,17為提純的DNA。從圖譜上看,基因組DNA的純度和質量較好。© 1994-2009 China Academic Journal

11、 Electronic Publishing House. All rights reserved. 第22卷第4期吳偉等:微衛(wèi)星DNA標記對5個中外黃牛品種/群體遺傳結構的研究7207/211的雜合體;第2條帶為207/207的純合體;第3,9條帶分別為215/221及209/211的雜合體。圖1基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1.ThepatternofgenomeDNAinagarosegelelec2tropheresisM:2DNA/EcoR+Hindmolecularweightmarker212微衛(wèi)星DNA的PCR擴增2IIDVGA-44對4個微衛(wèi)星DNA位點的PCR分別用

12、7%,PCR,GA-442)。從圖2,第1,4,5,6,8和10條帶為DNA的多態(tài)性21311微衛(wèi)星位點等位基因頻率4個微衛(wèi)星位點的等位基因分布及其頻率分別見表25。表2微衛(wèi)星IDVGA-11的等位基因分布及頻率Table2.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-11品種Breeds等位基因AllelesnN2140000010213218001010901025001036602200010326010167001010622201156301043501116700104262240109380116300109170

13、1036601053322601020801062501008301036601053322801354201337001408301280501340523001145801326101325001426801340523201229201021700118290111712340001008300101062360000010106南陽牛Nanyang6886104846604147延邊牛Yanbian韓牛Hanwoo西門塔爾牛Simmental雜種牛Crossbreed注:n為各品種/群體該位點的等位基因數;N為各品種/群體的樣本含量Note:n:numbersallelegeneoft

14、helocalityinthebreedsorpopulation;N:samplenumbersofbreedsorpopulation從表2可見,在IDVGA-11位點測定了242頭牛,共發(fā)現11個等位基因,變異范圍在214236bp之間,其中等位基因214和236僅見現10個等位基因,其變異范圍為203221bp,其中以等位基因207,209,211的頻率最高;同時等位基因219和221僅見于雜種牛,韓牛變異范圍相對較小(表4)。在位點IDVGA-46,檢測了265個個體,共發(fā)現10個等位基因,其變異范圍為201237bp,其中以等位基因205,207的頻率為最高;等位基因233和237

15、僅見于西門塔爾牛,219僅見于南陽牛,該位點在延邊牛和韓牛中變異較小(表5),這說明延邊牛和韓牛相對較純。于雜種牛中,分析可能來源于皮埃蒙特牛,同時在該位點南陽牛和西門塔爾牛的變異性較小。在位點IDVGA-27,檢測262個個體,共出現了6個等位基因,變異范圍為132142bp。在這個位點上,延邊牛和韓牛變異性較低,同時132僅見于南陽牛中,可能為南陽牛所特有(表3)。在位點IDVGA-44,檢測281個個體,共發(fā)© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 8

16、吉林農業(yè)大學學報2000年表3微衛(wèi)星IDVGA-27的等位基因分布及頻率Table3.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-27品種Breeds等位基因AllelesnN13201010400001340129160141301608301166701242413601041700011533011380162500142400126670136671400000114000142010313011630011250011733012727南陽牛Nanyang533554846607533延邊牛Yanbian韓牛Hanwo

17、o西門塔爾牛Simmental雜種牛Crossbreed表4IA-44smicrosatelliteIDVGA-44品種Breeds等位基因Alleles2030010109001050002050114610001006202070152070140220143330115000134052090117700120650118330125620117022110108320131520131670140000130852130103130001043801010621500001093801095721701041701065201066700101062190000010213221000

18、0010426南陽牛Nanyang654784846608047延邊牛Yanbian韓牛Hanwoo西門塔爾牛Simmental雜種牛Crossbreed表5微衛(wèi)星IDVGA-46的等位基因分布及頻率Table5.AllelesdistributionandfrequenciesofmicrosatelliteIDVGA-46品種Breeds等位基因AllelesnN2010101040000101142030105210000103402050127080179340182500165670138642070136460119570115830121640139772090010109010

19、167010224010227211012396000011364217010417000010114219010208000023300001007502370000109700南陽牛Nanyang733574846606744延邊牛Yanbian韓牛Hanwoo西門塔爾牛Simmental雜種牛Crossbreed21312微衛(wèi)星位點的群體雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數由相應公式計算得到群體雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數,結果見表6。就各位點來說,IDVGA-11的群體雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數這3項數據最高,而IDVGA-46的最低,說明4個位點中ID2VGA-11

20、變異最大,IDVGA-46變異最小;從品種來看,雜種牛的各項指標最高,韓牛的最低,這說明韓牛相對最純,而雜種牛的變異最大。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第22卷第4期吳偉等:微衛(wèi)星DNA標記對5個中外黃牛品種/群體遺傳結構的研究9表64個微衛(wèi)星位點在各品種/群體中的有效等位基因數(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)、群體雜合度(H)Table6.TheNumbersofeffectivealleles,polymorphisminformationc

21、ontentandheterozygosityoffourmicrosatellitelociineachbreeds/population品種位點LocusBreeds平均值西門塔爾牛Simmental31352201660601701741248201017646318256017139017386210489014715015119南陽牛NanyangNe412947017590017671210899015198015215101016666317221017112017313延邊牛Yanbian319328017202017457216531016231016231316696016

22、919114972012839013321韓牛Hanwoo31385201669101704621189201016545016739114165012599012940雜種牛Crossbreed3193890171540174613101319725017360017483310487016242016719Mean317808017049017330218488016217016070314218016823017039213467014701015082IDVGA-11PICHNeIDVGA-27PICHNeIDVGA-44HNeIDVGA-46PICH214品種/群體間遺傳距離和聚類分

23、析(Cluster)根據遺傳距離公式計算出中外5個黃牛品種的遺傳距離(表7)。從遺傳距離數值可看出,距離最近的是韓牛和延邊牛,其次是西門塔爾牛和延邊牛,西門塔爾牛和南陽牛間的距離最遠。雜種牛含有1/2的南陽牛血液,但是它同南陽牛之間的距離卻比韓牛與延邊牛間距離及西門塔爾牛與延邊牛間的距離中的任何1個都遠,這可能與雜種牛的父本與母本間遺傳距離相差太遠(1個是歐系牛,一個是中國型瘤牛)有關。利用表7中遺傳距離數據,用PHYLIP軟件中的NJ法對5個品種/群體進行聚類分析,同時用DISPEN軟件的NJ法再次聚類并進行Bootstrap檢驗,聚類結果見圖3、圖4。表7據微衛(wèi)星多態(tài)性得出的品種/群體間標

24、準遺傳距離Table7.Standardgeneticdistancesbetweenbreeds/populationbasedonmicrosatellitepolymorphisms品種Breeds南陽牛Nanyang0012364012989013519011307延邊牛Yanbian韓牛Hanwoo西門塔爾Simmental雜種牛Crossbreed南陽牛Nanyang延邊牛Yanbian001025001097601106300115660116670011135韓牛Hanwoo西門塔爾Simmental雜種牛Crossbreed在PHYLIP軟件中由NJ法得到的聚類圖(圖3)看出

25、:延邊牛和韓牛聚為一類(第2類),南陽牛和雜種牛聚為一類(第1類),這兩類最后再與西門塔爾牛聚為一類。同時還看出西門塔爾牛與第2類的距離更近一些。由DISPAN軟件中NJ法得到的聚類圖(圖4)看出,延邊牛和韓牛聚為一類,然后與西門塔爾牛聚為一類。而南陽牛和雜種牛則自成一類。© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 10+-Nanyang+-1!+Crossbreed!+Yanbian-3-2!+-Hanwoo!+-Simmental吉林農業(yè)大學學報2000年

26、和PIC值很高,是可以理解的。312群體間遺傳變異群體間遺傳距離是遺傳變異的尺度。從遺傳距離數值看,南陽牛和其它品種間的距離都很遠,說明瘤牛與普通牛之間遺傳關系較遠。西門塔爾牛、延邊牛、韓牛的遺傳距離較近說明它們同屬于普通牛。延邊牛和韓牛的遺傳距離最近,證明了延邊及韓國學者一致認為的延邊牛與韓牛源于一支,只是由于地理隔離、人工選擇等原因形成了2個不同的品種。圖3由NJ法得到的基于微衛(wèi)星多態(tài)性的聚類圖(PHYLIP)Fig.3.DendrogramwithNJbasedonmicrosatellitepoly2morphisms(PHYLIP)55,這些結果可,同,可為延邊牛開拓國際優(yōu)質肉牛市場

27、提供重要依據。4小結圖4由DISPEN得到的基于微衛(wèi)星多態(tài)性的聚類圖Fig.4.DendrogramwithDISPENsoftwarebasedonmi2crosatellitepolymorphismsBootstrap值是從100次重復抽樣得到的Bootstrapvaluesarebasedon100resamplings1)利用4個微衛(wèi)星標記IDVGA-11、IDV2GA-27、IDVGA-44、IDVGA-46分析了5個品種/群體牛的遺傳結構。其PIC、H、Ne平均值分別為:南陽牛016569/016716/312764、延邊牛015742/015982/218321、韓牛01531

28、7/015539/215144、西門塔爾牛016491/016792/313687、雜從品種特點來看:5個品種/群體中南陽牛為中國型瘤牛,而延邊牛、韓牛及歐系的西門塔爾牛,屬于普通牛,皮埃蒙特和南陽牛的雜種含有瘤牛和普通牛的血液,從NJ法聚類結果可見,南陽牛和雜種牛首先聚為一類,這是由于雜種牛含有1/2南陽牛血液,所以二者的遺傳距離相近。在DISPAN軟件中,NJ法將兩節(jié)點分別以69%和79%的概率驗證了PHYLIP軟件中的NJ法。種牛016869/017098/315038。雜種牛變異最大,韓牛變異最小,南陽牛變異也較大。2)本文采用NJ法把5個品種/群體分為三類:延邊牛和韓牛為一類,南陽牛和雜種牛為一類,西門塔爾牛自成一類,但西門塔爾牛與延邊牛及韓牛的關系更近一些,都屬于