抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測方法建立

1、抗黃曲霉毒素M1抗體制備及檢測方法建立    【關(guān)鍵詞】  黃曲霉毒素M1；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗摘要： 目的   制備針對黃曲霉毒素M1的單克隆抗體并建立針對黃曲霉毒素M1的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法。方法   利用B細胞雜交瘤技術(shù)，建立能分泌抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，制備抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法。結(jié)果   研制出1株能特異性分泌抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2F2。該單克隆抗體的Ig亞類為IgG1

2、，親和常數(shù)為28×10-11mol/L。該抗體與黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素M2等結(jié)構(gòu)類似物有微弱的交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。在此基礎(chǔ)上建立了間接競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法。該方法的最低檢出濃度為007ng/ml，校正曲線的線性范圍為0022ng/ml，線性方程y=-04364x+02693(R2=09949)。方法的加標回收率為725%1313%。結(jié)論   制備了具有高特異性和親和力的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，并建立了快速、靈敏的針對黃曲霉毒素M1的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法。關(guān)鍵詞： 黃曲霉毒素M1；單克隆抗體

3、；酶聯(lián)免疫吸附試驗Development of monoclonal antibody against aflatoxin M1 and immunoassay for aflatoxin M1   Abstract： Objective   To prepare monoclonal antibody against aflatoxin M1 and develop indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of aflatoxin M1.Methods&#

4、160;  Hybridoma cell line excreting monoclonal antibody against aflatoxin M1 was produced using B cell hybridoma technique and develop indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of aflatoxin M1.Results   One hybridoma cell line excreting monoclonal antibodies

5、 against aflatoxin M1 coded 2F2 was obtained by fusing murine Sp2/0 cells with spleen cells from BALB/c mice immunized with AFM1-BSA conjugate.The monoclonal antibody produced by the hybridoma cell were tested for subtype and designated as IgG1 for 2F2.The affinity of IgG in purified ascites yielded

6、 by hybridoma cell was 28×10-11 mol/L.The monoclonal antibody obtained in the present study was specific to aflatoxin M1,because of lightly cross reactions among the monoclonal antibodies against aflatoxin M1 with the analogues of aflatoxin B1,aflatoxin B2,aflatoxin G1,aflatoxin G2 and aflatoxi

7、n M2 were found.The limit of detecting concentration of aflatoxin M1 was 0.07 ng/ml.The linear range of standard curve was 0022ng/ml and the linear equation was y=-04364x+02693(R2=0.9949).The recovery of aflatoxin M1 was between 725%1313%.Conclusion   The monoclonal antibody obtained in th

8、e study was of relatively high specificity to aflatoxin M1,and a simple fast sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of aflatoxin M1 was developed.Key words： aflatoxin M1;monoclonal antibody;enzyme-linked immunosorbect assay      黃曲

9、霉毒素M1(aflatoxin M1,AFM1)是動物攝入黃曲霉毒素B1(AFB1)后在體內(nèi)經(jīng)羥基化代謝的產(chǎn)物，存在于動物體內(nèi)可食部分，如乳、肝、蛋類等，其中以乳最為常見，且乳與乳制品中的AFM1在生產(chǎn)和貯藏期間相對穩(wěn)定，巴氏消毒難以破壞1。AFM1的急性毒性與AFB1大致相同，可引起實驗動物發(fā)生腫瘤2，50g/(kgbw)的AFM1可致大鼠肝癌及結(jié)腸腺癌3，此外尚有AFM1引起牙原性腫瘤的報道4。鑒于AFM1對人類健康構(gòu)成潛在的威脅，在我國食用乳與乳制品者又多為嬰幼兒、老年人和體弱多病者，因此，必須對其含量進行監(jiān)控，限制AFM1在牛奶或乳制品中的污染水平，達到保護消費者健康的目的。因此，建立

10、精確、簡便、快速、靈敏、回收率高、不需特殊設(shè)備和可在基層實驗室開展的檢測分析方法十分必要。本文旨在制備抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，并對抗體特性進行鑒定，為進一步研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的免疫學(xué)快速檢測試劑盒提供技術(shù)支持。1   材料與方法11   材料111   器材   CO2培養(yǎng)箱(美國Queue公司)；潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；生物倒置顯微鏡(日本歐林巴斯光學(xué)株式會社)；酶標分析儀(瑞士SUNRISE公司)；電子分析天平(瑞士Mettler公司)；低溫高速離心機(德國Hermle公司)；普通離心機(北

11、京醫(yī)用離心機廠)；電泳儀(美國BIORAD公司)；微量可調(diào)移液器(法國Gilson公司)；細胞培養(yǎng)板(96孔(美國Costar公司)；24孔(美國Gibco公司)；酶標板(96孔，美國Corning公司)。112   試劑   黃曲霉毒素M1，黃曲霉毒素M1-BSA偶聯(lián)物(AFM1-BSA)、牛血清白蛋白(BSA)、抗體亞類測定試劑盒(IgM,IgG,IgA,IgD,IgG1,IgG2a,IgG2b,IgG3)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1)、黃曲霉毒素B2(Aflatoxin B2)、黃曲霉毒素G1(Aflatoxin G1)和黃曲霉毒素G

12、2(Aflatoxin G2)(美國Sigma公司)。RPMI 1640培養(yǎng)基，選擇性培養(yǎng)基，福氏佐劑(完全、不完全)、二甲基亞砜(DMSO)，3,3,5,5四甲基聯(lián)苯氨(TMB)、吐溫20(Tween 20)、聚乙二醇(PEG，MW 4000)、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)；辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(北京中山試劑公司)；30%H2O2(優(yōu)級純，北京化工廠)；二甲基甲酰胺、過碘酸鈉、辛酸、硼氫化鈉、無水乙醇、乙醚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、氫氧化銨、硫酸銨、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、乙酸鈉等，均為分析純以上(北京化學(xué)試劑商店)。113 

13、;  溶液系統(tǒng)   參考文獻5制備。114   細胞系與實驗動物   小鼠骨髓瘤細胞系Sp2/0由本室傳代，并經(jīng)8氮雜鳥嘌呤處理。雌性BALB/c小鼠，體重1820g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所動物繁育場)。12   方法121   免疫動物   采用小劑量長周期的免疫方案。對68周齡的雌性BALB/c小鼠，體重1820g，首次免疫用100g黃曲霉毒素M1-小牛血清白蛋白(BSA)與等量完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。2周后，用50g黃曲霉毒素M1-BSA與等量不完全

14、福氏佐劑混勻后，腹腔注射。此后每隔2周用50g黃曲霉毒素M1-BSA與等量不完全福氏佐劑混勻，腹腔注射。8周后脾內(nèi)免疫50g黃曲霉毒素M1-BSA作為加強免疫，3d后取脾細胞進行融合。122   細胞融合   免疫小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)以101混合，用50%聚乙二醇(PEG)作融合劑。融合細胞懸于含20%小牛血清的選擇培養(yǎng)基內(nèi)，分種于加有BALB/c小鼠腹腔滲出細胞作滋養(yǎng)層的96孔細胞培養(yǎng)板中，置5%CO2,37孵箱中培養(yǎng)，當鏡檢雜交瘤克隆生長達1/31/2視野時，取上清進行篩選。123   雜交瘤篩選及抗體檢測&#

15、160;  以黃曲霉毒素M1-BSA為包被抗原，用間接非競爭ELISA法篩選分泌抗黃曲霉毒素M1抗體的細胞孔，用黃曲霉毒素M1間接競爭抑制性ELISA法確證。以免疫小鼠的血清為陽性對照，以Sp2/0細胞培養(yǎng)的上清液為空白對照，以細胞培養(yǎng)板中未長出克隆的細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，陽性細胞孔的判定標準為(A試驗-A空白)/(A對照-A空白)21。百事通 124   雜交瘤細胞克隆化   采用培養(yǎng)瓶內(nèi)準確計數(shù)稀釋法8。當連續(xù)3次100%陽性，即可將雜交瘤細胞凍存于液氮罐中。125   單克隆抗體的生產(chǎn)   采用動

16、物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法6。126   單克隆抗體的純化   采用飽和硫酸銨法對腹水進行純化7。13   單克隆抗體的鑒定   抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類測定試劑盒進行測定。抗體IgG含量采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒進行測定?？贵w分子量采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法8?？贵w滴度測定以黃曲霉毒素M1-BSA為包被抗原，從110000開始將抗體進行倍比稀釋，以Sp2/0細胞培養(yǎng)上清為陰性對照，用間接非競爭ELISA方法測定抗體滴度，以(A試驗-A空白)/(A對照

17、-A空白)21的最大稀釋倍數(shù)為滴定終點。抗體親和力的測定采用間接非競爭性ELISA法，即測定抗體的親和常數(shù)9?？贵w的特異性和抗體的靈敏度用間接競爭抑制性ELISA法進行測定，參試毒素為黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1和黃曲霉毒素G2和黃曲霉毒素M2。14   樣品提取   按照國家標準方法提取10。15   黃曲霉毒素M1間接競爭抑制性酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法   試驗條件的最佳組合用棋盤滴定法確定。(1)用黃曲霉毒素M1-牛血清白蛋白連接物(00625ng/ml)包被酶標微孔板，每孔100l，4過夜

18、；(2)酶標板加入不同濃度的黃曲霉毒素M1標準溶液或樣品提取液和單克隆抗體溶液的混合液100l(該混合液為毒素標準溶液或樣品提取液與單克隆抗體溶液按11混合，提前混合好，4過夜)，37 1h；(3)酶標板加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，每孔100l，37 1h；(4)酶標板加底物溶液，每孔100l，37 30min；(5)每孔加入終止液50l，于450nm處測定吸光度值(A)。(6)計算：黃曲霉毒素M1含量(ng/g)=C*V1*V2*X/(W*V3)。式中：C為酶標板上測得的黃曲霉毒素M1濃度(ng/ml)，根據(jù)標準曲線求得；V1為樣品提取液的總體積(ml)；V2為定容樣液的體積(ml)

19、；V3為取出的樣品液的體積(ml)；X為樣品提取液的稀釋倍數(shù)；W為樣品的重量(g)。2   結(jié)果21   單克隆抗體的制備   用黃曲霉毒素M1-BSA免疫BALB/c小鼠獲得了較好的免疫應(yīng)答。細胞融合后，經(jīng)間接非競爭ELISA方法篩選，并用間接競爭ELISA方法確證，從中選擇出對黃曲霉毒素M1毒素有強抑制而陽性對照孔較強的細胞株，經(jīng)34次亞克隆，達到3次100%陽性，建立了1株穩(wěn)定分泌抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為2F2。22   單克隆抗體特性的鑒定   抗黃曲霉毒素M1抗

20、體亞類是IgG1，相對分子量是150KD，抗體的親和力常數(shù)是28×10-11 mol/L。抗體與黃曲霉毒素B1的交叉反應(yīng)率是155%，抗體與黃曲霉毒素G1的交叉反應(yīng)率是39%，抗體與黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2和牛血清白蛋白的交叉反應(yīng)率均<1%。23   黃曲霉毒素M1標準品校正曲線   用20%甲醇-磷酸鹽緩沖液將黃曲霉毒素M1配成不同濃度標準使用液(0,001,002,005,010,020,050,100,200,500,1000ng/ml)，將抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體按照1106稀釋，用間接競爭抑制性酶聯(lián)免疫吸

21、附試驗法測得校正曲線，線性范圍是0022ng/ml，線性方程是y=-04364x+02693(R2=09949)。最低檢出濃度為007ng/ml。24   加標回收試驗   從市場上購買鮮奶和奶粉，分別進行05g/kg和10g/kg加標回收試驗。對鮮奶樣品的平均加標回收率分別為(1125±96)%和(877±198)%，對奶粉的加標回收率分別為(1197±156)%和(1086±147)%，對各樣品的加標回收率范圍為725%1313%。3   討論在本研究中所制備的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，對

22、黃曲霉毒素M1具有高靈敏度和高特異性，可用于建立檢測乳與乳制品中AFM1污染水平的免疫學(xué)檢測方法，以期達到對各種奶制品開展大規(guī)模調(diào)查，了解我國奶和奶制品中黃曲霉毒素的污染水平。關(guān)于抗體的特異性，本研究選擇了黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M2和牛血清白蛋白進行交叉反應(yīng)。由于黃曲霉毒素在自然界中有許多衍生物，其結(jié)構(gòu)極其相似，建立在多克隆抗體基礎(chǔ)上的AFM1檢測方法多與其他黃曲霉毒素發(fā)生交叉反應(yīng)，而使其應(yīng)用價值降低11。本研究在對抗黃曲霉毒素M1雜交瘤細胞株大量篩選的基礎(chǔ)上，得到了1株能分泌抗AFM1的雜交瘤細胞株2F2，用該細胞株生產(chǎn)的抗體僅與黃曲霉毒素

23、B1和黃曲霉毒素G1有微弱的交叉反應(yīng)，與其他黃曲霉毒素的衍生物和牛血清白蛋白無交叉反應(yīng)。由于黃曲霉毒素M1是污染奶和奶制品的主要組分，因此，采用2F2抗體建立的ELISA方法可以確保對黃曲霉毒素M1具有高度的特異性，不會影響黃曲霉毒素M1ELISA試劑盒的實際應(yīng)用。本研究成功地篩選出能夠分泌抗黃曲霉毒素M1的單克隆抗體雜交瘤細胞株，制備出對黃曲霉毒素M1具有高親合力、高特異性的單克隆抗體，并建立了快速、靈敏的檢測鮮奶及奶粉中黃曲霉毒素M1污染水平的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測方法，為鮮奶及奶粉的快速篩檢提供了技術(shù)支持。參考文獻1   DP Heish,Cullen JM,Hsieh

24、 LS,et al.Cancer risks posed by aflatoxin M1J.Princess Takamatsu Symp，1985,16:57-65.2   Cusumano V,Costa GB,Trifiletti R,et al.Functional impairment of rat Kupffer cells induced by aflatoxin B and its metabolitesJ.FEMS-Immunological Medi-MIcrobiology,1995,10(2):151-155.3   Yoshizawa T,Yamashita A,Luo Y.Fumonisin occurrence in corn from high and low risk areas for human esophageal cancer in ChinaJ.Appl Environ Microbiol,1994,60(5):1626-1629.4   Sydenham EW,Thiel