12細(xì)胞周期(cellcycles)

1、第十二章 細(xì)胞周期(cell cycles)通常將通過(guò)細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞的生長(zhǎng)開(kāi)始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞結(jié)束為止所經(jīng)歷的過(guò)程稱為細(xì)胞周期(圖12-1)。在這一過(guò)程中, 細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。圖12-1 細(xì)胞周期及染色體行為 12.1.1 細(xì)胞周期時(shí)相及類型細(xì)胞周期是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程, 不同類型的細(xì)胞周期持續(xù)的時(shí)間不完全相同, 而且,細(xì)胞的分裂狀態(tài)也各有異。  細(xì)胞周期的時(shí)相根據(jù)光學(xué)顯微鏡所觀察到的細(xì)胞分裂時(shí)的活動(dòng), 將細(xì)胞周期分為兩個(gè)主要的時(shí)期: M期(M phase)和分裂間期(interphase)。M期包括細(xì)胞的有絲分裂和胞質(zhì)分裂兩個(gè)過(guò)程

2、。在有絲分裂的過(guò)程中, 復(fù)制的染色體被分到兩個(gè)細(xì)胞核中, 胞質(zhì)分裂則是將整個(gè)細(xì)胞一分為二, 形成兩個(gè)子細(xì)胞。分裂間期實(shí)際上是新細(xì)胞的生長(zhǎng)期, 根據(jù)新細(xì)胞從開(kāi)始生長(zhǎng)起到分裂前止的分裂間隔期中的生理和生化變化, 可分為: G1期(Gap1 phase), 即從M期結(jié)束到S期開(kāi)始前的一段間歇期; S期, 即DNA合成期(DNA synthetic phase);G2期(G2 phase), 即DNA合成后(S期)到有絲分裂前的一個(gè)間歇期。是否所有生物的細(xì)胞周期持續(xù)的都相同？主要差別在哪里？(是否所有生物的細(xì)胞周期持續(xù)的時(shí)間都相同？主要差別在哪里？（答案） 答: 不同生物的細(xì)胞周期時(shí)間不同, 同一系統(tǒng)

3、中不同細(xì)胞,其細(xì)胞周期的時(shí)間也有很大的差異。細(xì)胞周期所持續(xù)的時(shí)間一般為1232小時(shí), M期所持續(xù)的時(shí)間較短, 一般為3060分鐘, 分裂間期的時(shí)間跨度較長(zhǎng), 根據(jù)細(xì)胞的類型和所處的生理?xiàng)l件不同而不同, 有幾小時(shí)、幾天、幾周或更長(zhǎng)。如人的細(xì)胞周期約為24小時(shí)絲裂期30分鐘，G1期 9小時(shí)，S期 10小時(shí)，G2期 4.5小時(shí)。一般說(shuō)來(lái), S+G2+M的時(shí)間變化較小, 主要差別在G1期的長(zhǎng)短。如消化系統(tǒng), 小鼠食管和十二指腸上皮細(xì)胞, 它們的細(xì)胞周期時(shí)間, 分別為115小時(shí)和15小時(shí), 食管上皮細(xì)胞的G1期長(zhǎng)達(dá)103)不同生物的細(xì)胞周期時(shí)間不同, 同一系統(tǒng)中不同細(xì)胞,其細(xì)胞周期的時(shí)間也有很大的差異。

4、表12-1是幾種細(xì)胞的細(xì)胞周期的比較。表12-1 某些真核生物的細(xì)胞周期時(shí)間細(xì)胞類型 細(xì)胞周期時(shí)間 早期的蛙胚細(xì)胞 30分鐘酵母細(xì)胞 1.53小時(shí) 腸表皮細(xì)胞 12小時(shí) 培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞 20小時(shí) 人的肝細(xì)胞 1年   細(xì)胞周期和細(xì)胞類群在正常的情況下, 一個(gè)完整的細(xì)胞周期應(yīng)包括四個(gè)時(shí)期, 細(xì)胞沿著G1SG2M期的路線運(yùn)轉(zhuǎn),但在多細(xì)胞機(jī)體中, 細(xì)胞的分裂行為有所差異。根據(jù)細(xì)胞的分裂行為, 可將真核生物細(xì)胞分為三類: 持續(xù)分裂細(xì)胞,又稱周期性細(xì)胞, 即在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞。此類細(xì)胞的分裂周期非常正常, 有絲分裂的活性很高。 終端分化細(xì)胞, 即永久性失去了分裂能力的細(xì)胞，這

5、些細(xì)胞都是高度特化的細(xì)胞, 如哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、肌細(xì)胞等。 G0細(xì)胞,又稱休眠細(xì)胞，暫時(shí)脫離細(xì)胞周期,但在某些條件的誘導(dǎo)下重新進(jìn)入細(xì)胞周期。如肝細(xì)胞, 外科手術(shù)切除部分肝組成后可以誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞分裂。根據(jù)細(xì)胞分裂行為，可將細(xì)胞分為幾種類型？各有什么特點(diǎn)？(根據(jù)細(xì)胞分裂行為，可將細(xì)胞分為幾種類型？各有什么特點(diǎn)？（答案） 答: 根據(jù)細(xì)胞的分裂行為, 可將真核生物細(xì)胞分為三類:持續(xù)分裂細(xì)胞,又稱周期性細(xì)胞, 即在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)某些組織需要不斷的更新,組成這些組織的細(xì)胞就必須通過(guò)不斷分裂產(chǎn)生新細(xì)胞。此類細(xì)胞的分裂周期非常正常, 有絲分裂的活性很高。如性細(xì)胞(包括卵母細(xì)胞和精原細(xì)胞),它

6、們要不斷地產(chǎn)生配子; 造血干細(xì)胞需要不斷地產(chǎn)生紅細(xì)胞和白細(xì)胞;上皮基底層細(xì)胞需要通過(guò)分裂不斷補(bǔ)充表面老化死亡的細(xì)胞; 植物的根莖尖端細(xì)胞需要通過(guò)分裂進(jìn)行生長(zhǎng)等都是具有正常周期的持續(xù)分裂細(xì)胞。終端分化細(xì)胞, 即永久性失去了分裂能力的細(xì)胞，它們不可逆地脫離了細(xì)胞周期, 但保持了生理活性機(jī)能。這些細(xì)胞都是高度特化的細(xì)胞, 如哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、多形性白細(xì)胞、肌細(xì)胞等, 這些細(xì)胞一旦分化,就永遠(yuǎn)保持這種不分裂狀態(tài)直到死亡。G0細(xì)胞,又稱休眠細(xì)胞，暫時(shí)脫離細(xì)胞周期,不進(jìn)行DNA復(fù)制和分裂, 也稱靜止細(xì)胞群。但這些細(xì)胞可在某些條件的誘導(dǎo)下重新開(kāi)始DNA合成, 進(jìn)行細(xì)胞分裂。如肝細(xì)胞, 外科手術(shù)切除

7、部分肝組成后可以誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞分裂。淋巴細(xì)胞可通過(guò)與抗原的相互作用誘導(dǎo)增殖。在胚胎發(fā)育早期(卵裂期)，所有的細(xì)胞均為周期性細(xì)胞, 以后隨著發(fā)育成熟, 某些細(xì)胞進(jìn)入了GO期, 某些細(xì)胞分化后喪失分裂能力。到成體時(shí),只有少數(shù)細(xì)胞處于增殖狀態(tài), 它們的增殖僅作為補(bǔ)充丟失的細(xì)胞, 或?qū)ν饨绱碳さ姆磻?yīng)。)12.1.2 細(xì)胞周期的研究方法為了研究細(xì)胞周期的不同階段的生化特性必須獲得細(xì)胞周期一致性的細(xì)胞, 這就是細(xì)胞的同步化(synchronization)。細(xì)胞同步化分為自然同步化和人工同步化。自然同步化是自然界存在的現(xiàn)象, 人工同步化是利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法, 用各種理化因素處理獲得的同步化生長(zhǎng)的細(xì)胞。常用的

8、細(xì)胞人工同步化的方法分為選擇同步化、誘導(dǎo)同步化或者兩者的結(jié)合。  誘導(dǎo)同步法(induction synchrony)控制培養(yǎng)條件, 將非同步培養(yǎng)中的所有或大部分細(xì)胞暫時(shí)性地阻止在細(xì)胞周期的某個(gè)階段, 最終使所有細(xì)胞達(dá)到同步化生長(zhǎng)。常用的手段有改變溫度、添加代謝抑制劑將細(xì)胞阻止在細(xì)胞周期的某一階段。 胸腺嘧啶阻斷技術(shù)(thymidine block technique) 高濃度的胸腺嘧啶能夠阻斷DNA合成所需的核苷酸的合成, 因此將細(xì)胞群體培養(yǎng)在具有高濃度的胸腺嘧啶的培養(yǎng)液，可獲得同步化的細(xì)胞。 中期阻斷法 某些藥物，如秋水仙素可抑制微管的聚合, 因而抑制有絲分裂器的形成, 將細(xì)胞阻

9、斷在有絲分裂的中期。如何利用胸腺嘧啶和秋水仙素獲得同步培養(yǎng)的細(xì)胞？(如何利用胸腺嘧啶和秋水仙素獲得同步培養(yǎng)的細(xì)胞？（答案） 答: 高濃度的胸腺嘧啶能夠阻斷DNA合成所需的核苷酸的合成, 因此將細(xì)胞群體培養(yǎng)在具有高濃度的胸腺嘧啶的培養(yǎng)液中時(shí), 非同步化的細(xì)胞能夠正常地通過(guò)細(xì)胞周期, 但到達(dá)S期時(shí), 因DNA的合成被阻斷, 這些細(xì)胞不能順利通過(guò)S期進(jìn)入G2期。經(jīng)過(guò)對(duì)S期的短暫阻斷, 再改變胸腺嘧啶的濃度, 解除抑制, 所有的細(xì)胞都開(kāi)始DNA的合成, 即獲得處于同步生長(zhǎng)的細(xì)胞。秋水仙素可抑制微管的聚合, 因而抑制有絲分裂器的形成, 將細(xì)胞阻斷在有絲分裂的中期， 適當(dāng)時(shí)間后解除秋水仙素的作用，即獲得處

10、于中期的同步化的細(xì)胞。這一方法稱為中期阻斷法。)  選擇同步法(selection synchrony)用物理方法將處于細(xì)胞周期中同一階段的細(xì)胞從非同步的群體中分離出來(lái)。 選擇同步化可克服同步化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的毒性影響。常用的方法有： 有絲分裂選擇法是根據(jù)細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同階段的生理變化設(shè)計(jì)的一種方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是不受藥物的影響, 同步化程度高, 不足之處是分離的細(xì)胞少, 手續(xù)繁瑣。 細(xì)胞沉降分離法 此法主要用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，也可用于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞, 但獲得的細(xì)胞的同步化程度有限, 因同一時(shí)相的細(xì)胞大小并非都是一致的。有絲分裂選擇法和細(xì)胞沉降分離法獲得同步化細(xì)胞方法的原理有何不同？

11、(有絲分裂選擇法和細(xì)胞沉降分離法獲得同步化細(xì)胞方法的原理有何不同？（答案） 答: 有絲分裂選擇法是根據(jù)細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同階段的生理變化設(shè)計(jì)的一種方法。單層培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的非同步化的細(xì)胞群體中, 處于對(duì)數(shù)期增殖的細(xì)胞分裂活躍, 分裂指數(shù)高, 分裂細(xì)胞變圓、隆起, 與培養(yǎng)器的粘著性降低。此時(shí)輕輕搖動(dòng), M期的細(xì)胞就脫離器皿壁而懸浮于培養(yǎng)液中, 其它階段的細(xì)胞則不會(huì)脫落。將傾出培養(yǎng)液貯存于4保存, 再向培養(yǎng)瓶中加入37新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 經(jīng)1-2小時(shí), 再如同上法收集M期的細(xì)胞。每12小時(shí)搖動(dòng)并收集細(xì)胞, 最后集中所收集的培養(yǎng)液,離心后, 可獲得一定數(shù)量的M期的同步化細(xì)胞。此法的優(yōu)點(diǎn)是不受藥

12、物的影響, 同步化程度高, 不足之處是分離的細(xì)胞少, 手續(xù)繁瑣。細(xì)胞沉降分離法主要用于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。由于細(xì)胞在其周期過(guò)程中, 體積逐漸增大, 所以處于細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞體積不同。而細(xì)胞在某一離心力場(chǎng)中的沉降速度與其半徑平方成正比, 因此可用沉降法分離所處周期時(shí)相不同而大小不同的細(xì)胞。)  條件突變體(conditional mutants)的利用利用條件突變體可研究細(xì)胞周期中的重要事件，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期基因。例如溫度敏感突變使細(xì)胞對(duì)于某種溫度敏感，這樣可用正常溫度培養(yǎng)細(xì)胞而用突變溫度來(lái)研究突變的事件。利用條件突變，在酵母中鑒定了幾十種細(xì)胞分裂周期(cell-division cyc

13、le,cdc)突變體, 發(fā)現(xiàn)了一些重要的細(xì)胞周期調(diào)控基因。12.1.3 細(xì)胞周期各時(shí)相的合成活動(dòng)在細(xì)胞周期的不同階段中, 生化合成反應(yīng)是不同的。  G1期 (Gap1 phase)G1 期是從有絲分裂完成到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期, 又叫合成前期。此期主要合成rRNA、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。在G1期的后期, DNA合成酶的活性大大增加。G1期進(jìn)入S期與S期激活因子有關(guān)。如將S期和早G1期細(xì)胞融合,S期細(xì)胞可以誘導(dǎo)G1期細(xì)胞提前進(jìn)入S期, 表明早G1期細(xì)胞尚未出現(xiàn)S期激活因子。  S期 (synthesis phase)即DNA合成期。細(xì)胞周期中S期是最重要的一個(gè)時(shí)期, 在

14、此期, 除了DNA合成外, 同時(shí)還會(huì)合成組蛋白, DNA復(fù)制所需的酶都在這一時(shí)期合成。在S期, 組蛋白的mRNA水平可增加50倍。也就是說(shuō), DNA的合成和組蛋白的合成在時(shí)間上是同步的(圖12-2), 在密度上是相應(yīng)的, 從而使新合成的DNA得以及時(shí)包裝成核小體。另外, 推測(cè)組蛋白起到DNA復(fù)制延長(zhǎng)因子的作用, 沒(méi)有組蛋白的合成, DNA的復(fù)制就會(huì)停止。圖12-2 DNA和組蛋白合成的協(xié)同性實(shí)驗(yàn)將大鼠的肝組織部分切除, 誘導(dǎo)肝組織的細(xì)胞同步化生長(zhǎng)。手術(shù)后的不同時(shí)間注射3H標(biāo)記的亮氨酸和14C標(biāo)記的胸腺嘧啶, 1小時(shí)后測(cè)定DNA的放射性(實(shí)心圓)和組蛋白放射性(空心圓)，結(jié)果顯示它們的合成是同步

15、的。此外, 還發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制時(shí), 不同序列的復(fù)制先后是不同的: 常染色質(zhì): 先; 異染色質(zhì): 后;能轉(zhuǎn)錄的DNA: 先; 不能轉(zhuǎn)錄的DNA: 后;GC含量高: 先; AT含量高: 后;  G2 期 (G2 期)是DNA合成的后期。在這一時(shí)期, 主要是大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微管蛋白和成熟促進(jìn)因子MPF(maturation promoting factor)等，為有絲分裂作準(zhǔn)備。   有絲分裂期(mitotic phase,M 期)從細(xì)胞分裂開(kāi)始到結(jié)束所經(jīng)歷的過(guò)程, 也就是從染色體的凝縮、分離到平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞為止。分裂后, S期合成的DNA減半。這一期的

16、特點(diǎn)是RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 以及染色體高度螺旋化。12.1.4 細(xì)胞周期中細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞周期各階段的生化變化必然會(huì)引起細(xì)胞的表型變化, 包括外部表型和內(nèi)部表型。  細(xì)胞形態(tài)的變化在細(xì)胞周期的不同階段，細(xì)胞的形態(tài)變化很大，如處于S期的細(xì)胞多呈扁平狀, 緊貼在培養(yǎng)瓶壁上, 細(xì)胞表面的微絨毛和小泡很少。   細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化內(nèi)部結(jié)構(gòu)的最大變化是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。與染色體復(fù)制周期相關(guān)聯(lián)的是核仁的變化。根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的生化活動(dòng)，推測(cè)細(xì)胞的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)各有哪些變化？(根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的生化活動(dòng)，推測(cè)細(xì)胞的表面形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)各有哪些變化？（答案） 答:

17、 由于細(xì)胞周期的各時(shí)相的生化活動(dòng)不同，引起不同的表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化：細(xì)胞形態(tài)的變化： 如處于S期的細(xì)胞呈扁平狀, 緊貼在培養(yǎng)瓶壁上, 細(xì)胞表面的微絨毛和小泡很少。 細(xì)胞進(jìn)入G2期, 特別是G2期的中后期, 細(xì)胞漸漸從貼壁攤平的狀態(tài)鼓起來(lái), 而細(xì)胞表面的微絨毛增多, 此時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶, 細(xì)胞很容易與瓶壁脫離。進(jìn)入M期的細(xì)胞, 變成球形。細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化 內(nèi)部結(jié)構(gòu)的最大變化是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。在S期, 染色體處于極松散的狀態(tài), DNA半保留復(fù)制和核小體八聚體組蛋白全保留方式偶聯(lián)。到G2期已形成兩條染色質(zhì)纖維; 到M期, 染色單體形成。與染色體復(fù)制周期相關(guān)聯(lián)的是核仁的變化。從細(xì)胞分裂前期到M期中期

18、, 核仁消失, 核膜解體；分裂后期重新形成核膜。在間期-分裂期過(guò)渡中, 有兩點(diǎn)明顯的變化: 一是形成紡錘體, 需要大量的微管蛋白，另一是細(xì)胞表面微絨毛的形成，這與細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)。)  細(xì)胞器的分裂和片段化有絲分裂不僅要保證新形成的子細(xì)胞得到全套的遺傳物質(zhì), 同時(shí)要保證子細(xì)胞得到其他必備的細(xì)胞結(jié)構(gòu), 包括膜結(jié)合細(xì)胞器。由于線粒體和葉綠體等不能自我裝配, 只能靠已有的線粒體和葉綠體的生長(zhǎng)和分裂產(chǎn)生, 所以, 線粒體和葉綠體與細(xì)胞分裂同步, 使數(shù)量加倍。其他的膜結(jié)合細(xì)胞器, 如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等要伸長(zhǎng)并斷成片段, 這樣增加了均等分配的機(jī)會(huì)。12.2 細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞周期的研究不

19、僅是基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)的重要研究課題,而且對(duì)于癌癥的研究也有十分重要的意義，癌實(shí)際上是破壞了細(xì)胞分裂調(diào)控能力的一種疾病。2001年諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了美國(guó)科學(xué)家利蘭·哈特韋爾和英國(guó)科學(xué)家蒂莫西·亨特、保羅·納西，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)機(jī)制。美國(guó)科學(xué)家利蘭·哈特韋爾和英國(guó)科學(xué)家蒂莫西·亨特、保羅·納西在細(xì)胞周期調(diào)控研究中各自的貢獻(xiàn)是什么？(美國(guó)科學(xué)家利蘭·哈特韋爾和英國(guó)科學(xué)家蒂莫西·亨特、保羅·納西分享了2001年的生理學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)，他們各自的貢獻(xiàn)是什么？（答案） 答: 利蘭·哈

20、特韋爾發(fā)現(xiàn)了“START”基因；保羅·納西的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了CDK。蒂莫西·亨特的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)CDK的功能物質(zhì)CYCLIN。) 12.2.1 細(xì)胞周期調(diào)控概述從調(diào)控的觀點(diǎn)來(lái)看, 細(xì)胞周期的調(diào)控操作就象一部全自動(dòng)的洗衣機(jī)。洗衣機(jī)的基本操作是加水、洗滌、漂洗和甩干。洗衣機(jī)的這些基本循環(huán)同細(xì)胞周期中的DNA復(fù)制、有絲分裂等的基本循環(huán)是相似的。在這兩種情況下, 都是通過(guò)中央控制系統(tǒng)(central control system)控制的。在原理上, 洗衣機(jī)細(xì)胞周期的控制操作都象是一部定時(shí)器, 但實(shí)際上, 無(wú)論是洗衣機(jī)還是細(xì)胞周期, 它們都是根據(jù)在不同過(guò)程中的信息反饋來(lái)進(jìn)行自

21、我調(diào)節(jié)。在每一個(gè)過(guò)程中, 都是通過(guò)檢測(cè)器的作用, 向控制中心發(fā)回信號(hào)（圖12-3）。圖12-3 細(xì)胞周期控制模擬系統(tǒng)細(xì)胞周期中的基本事件, 如DNA復(fù)制、有絲分裂、胞質(zhì)分裂都是通過(guò)中央的細(xì)胞周期控制系統(tǒng)控制的。中央控制系統(tǒng)如同一個(gè)順時(shí)鐘移動(dòng)的指針, 當(dāng)它到達(dá)某一位置時(shí)觸發(fā)一個(gè)反應(yīng)。關(guān)于細(xì)胞周期調(diào)控的方式,早期有兩種觀點(diǎn), 一種是連鎖反應(yīng),另一種是協(xié)同反應(yīng)(圖12-4)。 圖12-4 細(xì)胞周期調(diào)控的兩種模式骨牌代表細(xì)胞周期的基本事件，如DNA復(fù)制、染色體凝集、紡錘體形成等。（A）一個(gè)事件的發(fā)生觸發(fā)下一個(gè)事件的發(fā)生；（B）一個(gè)事件的發(fā)生并不意味著下一個(gè)事件必然發(fā)生，但可作為下一個(gè)事件發(fā)生的起因，這

22、要通過(guò)控制系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。（B）較（A）更為合理。12.2.2 蛋白激酶在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用實(shí)際上, 細(xì)胞周期的控制系統(tǒng)是一個(gè)典型的生化操作裝置, 這種裝置是由一套相互作用的蛋白質(zhì)組成, 正是這些蛋白質(zhì)間的相互作用, 使細(xì)胞的組分加倍并進(jìn)行再分配。  細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期的控制有兩個(gè)主要事件，一個(gè)是對(duì)DNA復(fù)制起始的控制，發(fā)生在G1期和 S期之間。第二個(gè)事件是對(duì)染色體凝集的控制，發(fā)生在G2期和M期之間。1970年，Colorado 大學(xué)的Potu Rao 和 Robert Johnson 通過(guò)一系列的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)打開(kāi)了認(rèn)識(shí)細(xì)胞周期中這兩個(gè)事件的大門。 DNA復(fù)制起始的控制因

23、子首先他們將同步培養(yǎng)的G1期的Hela細(xì)胞同S期的Hela細(xì)胞進(jìn)行融合,發(fā)現(xiàn),G1期的細(xì)胞質(zhì)受到S期細(xì)胞質(zhì)的激活, 開(kāi)始了DNA復(fù)制, 這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 正在進(jìn)行復(fù)制的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有促進(jìn)G1期細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制的起始因子。與此相反, 他們將S期的細(xì)胞與G2期的細(xì)胞進(jìn)行融合, 發(fā)現(xiàn)G2期的細(xì)胞核不能再啟動(dòng)DNA的復(fù)制, 這表明, S期的細(xì)胞質(zhì)中的DNA復(fù)制起始因子對(duì)于已進(jìn)行了DNA復(fù)制的G2期的細(xì)胞核沒(méi)有作用。 染色體早熟凝集將處于分裂期的細(xì)胞與處于細(xì)胞周期其他階段的細(xì)胞融合, M期的細(xì)胞質(zhì)總是能夠誘導(dǎo)非有絲分裂的細(xì)胞中的染色質(zhì)凝集（圖12-5）, 這種現(xiàn)象稱為染色體早熟凝集(premat

24、ure chromosome condensation,PCC)。 圖12-5 早熟染色體凝集實(shí)驗(yàn)將同步化培養(yǎng)的M期Hela細(xì)胞分別與間期不同階段同步化的細(xì)胞融合，產(chǎn)生形態(tài)各異的早熟染色體。（a）M+G1;(b)M+S;(c)M+G2。什么是染色體早熟凝集實(shí)驗(yàn)？為什么同步化的M期細(xì)胞與其他時(shí)期的細(xì)胞融合，早熟凝集的染色體形態(tài)不同？(什么是染色體早熟凝集實(shí)驗(yàn)？為什么同步化的M期細(xì)胞與其他時(shí)期的細(xì)胞融合，早熟凝集的染色體形態(tài)不同？（答案） 將處于分裂期的細(xì)胞（M期）與處于細(xì)胞周期其他時(shí)期（G1期、S期、G2期）的細(xì)胞融合, M期的細(xì)胞質(zhì)總是能夠誘導(dǎo)非有絲分裂的細(xì)胞中的染色質(zhì)凝集, 將這種現(xiàn)象稱為染

25、色體早熟凝集(premature chromosome condensation,PCC)。由于G1期、S期和G2期細(xì)胞中染色質(zhì)的復(fù)制狀態(tài)不同, PCC的結(jié)果也不相同, 如與M期細(xì)胞融合的G1期的染色體為單線狀, S期為粉末狀, G2期染色體為雙線。致于早熟凝集的染色體形態(tài)為什么不同，主要與各期DNA復(fù)制的狀態(tài)有關(guān)：S期的細(xì)胞與M期的細(xì)胞融合, 早熟的染色體呈粉末狀, 原因是正在復(fù)制的DNA易受損傷,是DNA斷裂的結(jié)果；而M期細(xì)胞與G1期細(xì)胞融合，出現(xiàn)細(xì)線狀，是由于染色體還沒(méi)有完全去凝集，DNA復(fù)制尚未開(kāi)始。由于G2期DNA已經(jīng)復(fù)制完全，所以與M期細(xì)胞融合呈現(xiàn)雙線狀。這些研究結(jié)果說(shuō)明處于M期的

26、細(xì)胞中一定有一種使染色體由松散狀態(tài)凝聚成染色體的物質(zhì)存在。)  成熟促進(jìn)因子MPF(maturation promoting factor，MPF)的發(fā)現(xiàn)為了進(jìn)一步研究促使G1期細(xì)胞DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂的調(diào)節(jié)因子的本質(zhì), 用蛙和無(wú)脊椎動(dòng)物的卵母細(xì)胞及早期的胚進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。(在研究促使G1期細(xì)胞DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂的調(diào)節(jié)因子的本質(zhì)時(shí), 為什么選用蛙和無(wú)脊椎動(dòng)物的卵母細(xì)胞及早期的胚進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)？（答案） 答: 一些動(dòng)物的受精卵特別適合作為細(xì)胞周期的研究材料, 因?yàn)檫@些卵細(xì)胞特別大, 如蛙的卵細(xì)胞的直徑可達(dá)1 mm, 并且在受精后進(jìn)行快速胚胎發(fā)育,

27、 通過(guò)細(xì)胞周期進(jìn)行分裂, 產(chǎn)生許多小細(xì)胞。在每個(gè)細(xì)胞周期之間,G1期和G2期很短, 或沒(méi)有G1期和G2期, 但是都有S期和M期。在受精卵的發(fā)育過(guò)程中, 沒(méi)有新基因的轉(zhuǎn)錄, 因?yàn)榕咛ピ缙诎l(fā)育階段所需的mRNA和大多數(shù)蛋白質(zhì)都是在卵母細(xì)胞形成時(shí)就合成好了并被包裝在成熟的卵細(xì)胞中。另外在早期的細(xì)胞分裂周期中,細(xì)胞也不會(huì)生長(zhǎng),所有的細(xì)胞都是通過(guò)對(duì)稱分裂形成兩個(gè)小細(xì)胞。在細(xì)胞周期的特定階段分離蛙的卵細(xì)胞, 并從蛙卵細(xì)胞中制備提取物。為了檢測(cè)蛙卵提取物的生物活性,將它注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞(未受精卵的不成熟的前體),觀察這些提取物對(duì)細(xì)胞周期的影響。這種卵母細(xì)胞是檢測(cè)提取物活性的良好系統(tǒng), 因?yàn)檫@種細(xì)胞已

28、經(jīng)完成了DNA復(fù)制并正好停留在第一次有絲分裂的M期之前, 如果注射物具促分裂活性的話, 即可使注射的卵母細(xì)胞進(jìn)入M期。因此卵母細(xì)胞所處的細(xì)胞周期階段等于周期細(xì)胞的G2期。) 注射實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞周期的特定階段分離蛙的卵細(xì)胞, 并從蛙卵細(xì)胞中制備提取物。為了檢測(cè)蛙卵提取物的生物活性,將它注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞(未受精卵的不成熟的前體),觀察這些提取物對(duì)細(xì)胞周期的影響。發(fā)現(xiàn)注射來(lái)自M期卵細(xì)胞中的提取物, 可使卵母細(xì)胞進(jìn)入M期。而用來(lái)自細(xì)胞周期其他階段的提取物注射卵母細(xì)胞則不能誘導(dǎo)進(jìn)入M期(圖12-6), 這是首次發(fā)現(xiàn)在M期的細(xì)胞中有促進(jìn)細(xì)胞分裂的因子存在, 由于當(dāng)時(shí)對(duì)這種因子的化學(xué)本質(zhì)和作用機(jī)

29、制都不清楚, 只是簡(jiǎn)單地稱為M-期促進(jìn)因子(M-phase promoting factor, MPF),后來(lái)稱為成熟促進(jìn)因子。圖12-6 MPF活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)(a)用非洲爪蟾M期的卵細(xì)胞細(xì)胞提取物注射非洲爪蟾的卵母細(xì)胞,注射的細(xì)胞提取物驅(qū)使卵母細(xì)胞進(jìn)入M期, 使核破裂, 并形成紡錘體。(b)用細(xì)胞間期的提取物注射卵母細(xì)胞, 不能驅(qū)使卵母細(xì)胞進(jìn)入M期。在研究促使G1期細(xì)胞DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂的調(diào)節(jié)因子的本質(zhì)時(shí), 為什么選用蛙和無(wú)脊椎動(dòng)物的卵母細(xì)胞及早期的胚進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)？(在研究促使G1期細(xì)胞DNA復(fù)制以及誘導(dǎo)細(xì)胞提前進(jìn)入有絲分裂的調(diào)節(jié)因子的本質(zhì)時(shí), 為什么選用蛙和無(wú)脊椎動(dòng)物的卵

30、母細(xì)胞及早期的胚進(jìn)行注射實(shí)驗(yàn)？（答案） 答: 一些動(dòng)物的受精卵特別適合作為細(xì)胞周期的研究材料, 因?yàn)檫@些卵細(xì)胞特別大, 如蛙的卵細(xì)胞的直徑可達(dá)1 mm, 并且在受精后進(jìn)行快速胚胎發(fā)育, 通過(guò)細(xì)胞周期進(jìn)行分裂, 產(chǎn)生許多小細(xì)胞。在每個(gè)細(xì)胞周期之間,G1期和G2期很短, 或沒(méi)有G1期和G2期, 但是都有S期和M期。在受精卵的發(fā)育過(guò)程中, 沒(méi)有新基因的轉(zhuǎn)錄, 因?yàn)榕咛ピ缙诎l(fā)育階段所需的mRNA和大多數(shù)蛋白質(zhì)都是在卵母細(xì)胞形成時(shí)就合成好了并被包裝在成熟的卵細(xì)胞中。另外在早期的細(xì)胞分裂周期中,細(xì)胞也不會(huì)生長(zhǎng),所有的細(xì)胞都是通過(guò)對(duì)稱分裂形成兩個(gè)小細(xì)胞。在細(xì)胞周期的特定階段分離蛙的卵細(xì)胞, 并從蛙卵細(xì)胞中制

31、備提取物。為了檢測(cè)蛙卵提取物的生物活性,將它注射到非洲爪蟾的卵母細(xì)胞(未受精卵的不成熟的前體),觀察這些提取物對(duì)細(xì)胞周期的影響。這種卵母細(xì)胞是檢測(cè)提取物活性的良好系統(tǒng), 因?yàn)檫@種細(xì)胞已經(jīng)完成了DNA復(fù)制并正好停留在第一次有絲分裂的M期之前, 如果注射物具促分裂活性的話, 即可使注射的卵母細(xì)胞進(jìn)入M期。因此卵母細(xì)胞所處的細(xì)胞周期階段等于周期細(xì)胞的G2期。)雖然MPF首先發(fā)現(xiàn)于蛙的卵細(xì)胞, 但在所實(shí)驗(yàn)國(guó)的所有動(dòng)物細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了MPF, 說(shuō)明這種因子是普遍存在的。 MPF的結(jié)構(gòu)由于MPF的純化工作困難,所以對(duì)它的純化工作持續(xù)了好幾年, 最后用柱層析純化了MPF, 實(shí)際上MPF是兩個(gè)不同的亞基組成的異

32、質(zhì)二聚體(圖12-7), 一個(gè)是催化亞基, 它能夠?qū)⒘姿峄鶊F(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到特定底物的絲氨酸和蘇氨酸殘基上, 這種蛋白激酶后來(lái)被稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases, Cdks);另一個(gè)亞基稱作周期蛋白(cyclin)。圖12-7 周期蛋白-Cdk復(fù)合的組成 細(xì)胞周期中MPF的濃度變化通過(guò)注射實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn), MPF的活性在細(xì)胞周期中波動(dòng)很大, 在有絲分裂前急劇升高, 但在有絲分裂后急劇下降直到零。由于MPF蛋白激酶亞基不能單獨(dú)起作用, 它需要與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才有功能。周期蛋白濃度在細(xì)胞周期中是浮動(dòng)的, 呈周期性變化。同樣, MPF的活性與周

33、期蛋白一樣在細(xì)胞周期中呈現(xiàn)周期性變化(圖12-8)。圖12-8 在細(xì)胞周期中周期蛋白和MPF的波動(dòng)(a) 蛙胚細(xì)胞發(fā)生同步分裂時(shí), 早期發(fā)育的周期性變化。上部是有絲分裂和分裂間期的周期變化; 中間曲線是MPF活性的周期性變化; 下部曲線是控制MPF激酶相對(duì)活性的周期蛋白的濃度的周期性變化。(b)在酵母的一次細(xì)胞周期中MPF的活性和周期蛋白濃度變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 注射實(shí)驗(yàn)的推論注射實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：當(dāng)細(xì)胞周期蛋白的濃度降低時(shí), 蛋白激酶由于缺少與之結(jié)合的底物,而失活。當(dāng)周期蛋白的濃度上升時(shí), 蛋白激酶被激活, 促使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。因此推測(cè)：細(xì)胞周期的進(jìn)程依賴于一種酶的激活, 而這種酶的惟一活性是使

34、其他蛋白磷酸化;酶的活性受一種亞基的控制, 它的濃度在細(xì)胞周期的不同階段是不同的。  周期蛋白的鑒定在海膽的早期胚細(xì)胞中第一次鑒定到與MPF結(jié)合的周期蛋白。實(shí)驗(yàn)中將同步化的受精的海膽卵培養(yǎng)在有放射性氨基酸的培養(yǎng)液中, 然后每10分鐘取樣一次、分離純化蛋白質(zhì)、凝膠電泳、放射自顯影進(jìn)行蛋白分析。發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過(guò)幾輪細(xì)胞周期之后, 放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)的量穩(wěn)定增加, 但是, 其中有一種蛋白峰在有絲分裂的早期特別高, 到了有絲分裂后期就急劇下降。然后在下一個(gè)細(xì)胞周期又慢慢積累直到有絲分裂前達(dá)到高峰。后來(lái)將這種蛋白命名為周期蛋白B(cyclin B)，通過(guò)基因工程技術(shù)從海膽中分離了周期蛋白B的cDN

35、A克隆, 并通過(guò)抗體技術(shù)證明了非洲爪蟾中MPF的一個(gè)亞基的確是周期蛋白B。  遍在蛋白介導(dǎo)的有絲分裂周期蛋白的降解促使細(xì)胞退出有絲分裂 周期蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有三種周期蛋白激發(fā)非洲爪蟾卵母細(xì)胞成熟: 周期蛋白A和兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的周期蛋白B。不同來(lái)源的編碼周期蛋白的cDNA序列分析表明, 所有這些蛋白的氨基酸序列中, 靠近N端都有一個(gè)稱為破壞框(destruction box)的同源區(qū)(圖12-9a)。有絲分裂周期蛋白在遍在蛋白介導(dǎo)下降解促使細(xì)胞退出有絲分裂（圖12-9b）。圖12-9 有絲分裂周期蛋白聚遍在蛋白化作用 遍在蛋白介導(dǎo)周期蛋白的降解有絲分裂周期蛋白合成之后, 就有遍在蛋白與之結(jié)

36、合,然后通過(guò)遍在蛋白聚合作用(polyubiquitination)將周期蛋白進(jìn)行標(biāo)記以便蛋白酶體迅速降解。遍在蛋白如何介導(dǎo)周期蛋白的降解？(遍在蛋白如何介導(dǎo)周期蛋白的降解？（答案） 答:遍在蛋白加到周期蛋白上需要三種不同的酶介導(dǎo)。首先遍在蛋白在它的羧基端通過(guò)與遍在蛋白激活酶E1的半胱氨酸殘基形成硫酯鍵而激活。然后遍在蛋白從E1轉(zhuǎn)移到E2的半胱氨酸殘基, E2稱作遍在蛋白結(jié)合酶(ubiquitin)。E2和第三種酶, 遍在蛋白連接酶(ubiquitin ligase, E3)一起將遍在蛋白轉(zhuǎn)移到底物蛋白的賴氨酸殘基（共價(jià)結(jié)合）, 在那里進(jìn)行遍在蛋白的聚合化,最后作為蛋白酶體的降解底物, 被快速

37、降解。 E3通常是一種復(fù)合體,由多亞基組成。例如從非洲爪蟾卵細(xì)胞中分離的周期蛋白B的E3至少含有8個(gè)不同的亞基。觸發(fā)有絲分裂周期蛋白遍在蛋白聚合化的E3又稱為后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex,APC)。APC激發(fā)E2-遍在蛋白復(fù)合物同有絲分裂周期蛋白破壞框結(jié)合, 然后激發(fā)遍在蛋白同破壞框C-末端的賴氨酸殘基結(jié)合，此過(guò)程不斷循環(huán)使遍在蛋白聚合化。通過(guò)基因操作構(gòu)建了不含破壞框的周期蛋白, 這些蛋白不會(huì)被降解。)  APC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋白B的降解在有絲分裂的后期末, 必須對(duì)周期蛋白進(jìn)行快速降解，才能保證細(xì)胞順利進(jìn)入G1期。通過(guò)對(duì)周期蛋白B的研究，發(fā)

38、現(xiàn)后期周期蛋白B的降解是通過(guò)對(duì)后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase-promoting complex,APC)活性的控制進(jìn)行調(diào)節(jié)的。從阻斷在中期的非洲爪蟾卵細(xì)胞中分離的APC對(duì)于激發(fā)周期蛋白B的遍在蛋白聚合化的活性很低。相反,從具有正常細(xì)胞周期的非洲爪蟾的卵細(xì)胞中分離的APC具有較高的激發(fā)遍在蛋白聚合化的活性。具有較高活性的APC復(fù)合物中有幾個(gè)亞基是被磷酸化的。用磷酸酶除去APC中磷酸化位點(diǎn)的磷酸基團(tuán), 會(huì)降低APC的活性。圖12-10是活性調(diào)節(jié)及其在細(xì)胞周期后期促使周期蛋白B降解的作用模型。圖12-10 周期細(xì)胞中有絲分裂周期蛋白水平的調(diào)節(jié)  細(xì)胞怎樣通過(guò)對(duì)APC的活性調(diào)節(jié)控制周期蛋

39、白B的降解？(APC的活性調(diào)節(jié)及在周期蛋白B降解中的作用如何？（答案） 答: 當(dāng)MPF的 活性在有絲分裂中期達(dá)到最高峰時(shí), 它將APC磷酸化并將其激活。被激活的APC與E2結(jié)合, 最后結(jié)合到周期蛋白B的破壞框中, 促使周期蛋白B的進(jìn)行遍在蛋白多聚化, 其結(jié)果導(dǎo)致周期蛋白B降解。由于周期蛋白B是MPF的一個(gè)必需亞基, 它的降解勢(shì)必導(dǎo)致MPF活性降低甚至失活, 觸發(fā)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂末期。胞質(zhì)分裂之后, 周期蛋白B在子細(xì)胞的間期合成, APC的活性保持到G1期的后期, 被G1 Cdk失活。周期蛋白B的濃度不斷升高,同時(shí)提高M(jìn)PF的活性, 以便進(jìn)入下一個(gè)有絲分裂期。)  真核生物細(xì)胞周期調(diào)控

40、的一般模型在發(fā)現(xiàn)MPF后的一、二十年中, 細(xì)胞周期調(diào)控一直集中在對(duì)MPF樣(MPF-like)酶的研究, 這類酶稱為周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases, Cdks)，主要功能是控制細(xì)胞周期的活性; 研究的生物也從蛙卵母細(xì)胞和胚胎轉(zhuǎn)向酵母和培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。圖12-11是真核細(xì)胞周期調(diào)控的現(xiàn)代模型。 三類周期蛋白-Cdk復(fù)合物真核細(xì)胞主要通過(guò)三類周期蛋白-Cdk復(fù)合物的作用，控制細(xì)胞周期, 這三種復(fù)合物分別是:G1期、S期和有絲分裂Cdk復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞被激活進(jìn)行復(fù)制時(shí), 首先是G1 Cdk復(fù)合物進(jìn)行表達(dá)。準(zhǔn)備進(jìn)入S期的細(xì)胞通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子,

41、引起DNA復(fù)制所需酶類以及編碼S期Cdk復(fù)合物的基因表達(dá)。S期Cdk的活性開(kāi)始被一種特殊抑制物所抑制, 而在G1期的后期, G1 Cdk復(fù)合物誘導(dǎo)S期Cdk抑制物的降解, 釋放出有活性的S期Cdk復(fù)合物,這種復(fù)合物能夠激發(fā)細(xì)胞進(jìn)入S期。   圖12-11 真核生物細(xì)胞周期調(diào)控模型 細(xì)胞周期分別被G1、S-期、有絲分裂依賴性的蛋白激酶(CdkCs)控制。這些激酶都是由周期蛋白依賴性的蛋白激酶和周期蛋白兩個(gè)亞基組成的復(fù)合物。在Cdc34途徑和APC途徑中,蛋白復(fù)合物都是通過(guò)遍在蛋白的蛋白酶體將一些特殊的底物, 包括S期抑制物、后期抑制物、以及有絲分裂周期蛋白降解進(jìn)行周期調(diào)節(jié)。因此這些蛋白

42、驅(qū)使細(xì)胞周期沿一個(gè)方向進(jìn)行, 因?yàn)檫@些降解作用是不可逆轉(zhuǎn)的。后期抑制物的蛋白酶解使得姐妹染色單體分開(kāi), 細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的末期。 細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞質(zhì)分裂期的過(guò)渡。這些過(guò)渡都是通過(guò)觸發(fā)蛋白質(zhì)的降解進(jìn)行的, 所以都是不可逆轉(zhuǎn)的, 這樣迫使細(xì)胞周期只能沿一個(gè)方向進(jìn)行。三個(gè)過(guò)渡分別是通過(guò)Cdc34和APC途徑的降解作用完成的。真核細(xì)胞周期調(diào)控模型的主要特點(diǎn)和機(jī)制是什么？(真核細(xì)胞周期調(diào)控模型的主要特點(diǎn)和機(jī)制是什么？（答案） 答: 特點(diǎn)表現(xiàn)在三類周期蛋白-Cdk復(fù)合物和三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡和對(duì)細(xì)胞周期的控制。細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡細(xì)胞周期

43、中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞質(zhì)分裂期是細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵過(guò)渡。這三個(gè)過(guò)渡分別被Cdc34途徑和APC途徑控制。三類周期蛋白-Cdk復(fù)合物真核細(xì)胞主要通過(guò)三類周期蛋白-Cdk復(fù)合物的作用，控制細(xì)胞周期, 這三種復(fù)合物分別是:G1期、S期和有絲分裂Cdk復(fù)合物。這些復(fù)合物都是由周期蛋白依賴性的蛋白激酶和周期蛋白兩個(gè)亞基組成的復(fù)合物。在Cdc34途徑和APC途徑中,蛋白復(fù)合物都是通過(guò)遍在蛋白的蛋白酶體將一些特殊的底物, 包括S期抑制物、后期抑制物、以及有絲分裂周期蛋白降解進(jìn)行周期調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡細(xì)胞周期中三個(gè)關(guān)鍵的過(guò)渡,即G1期S期、中期后期、后期末期及胞質(zhì)分

44、裂期的過(guò)渡。這些過(guò)渡都是通過(guò)觸發(fā)蛋白質(zhì)的降解進(jìn)行的, 所以都是不可逆轉(zhuǎn)的, 這樣迫使細(xì)胞周期只能沿一個(gè)方向進(jìn)行。三個(gè)過(guò)渡分別是通過(guò)Cdc34和APC途徑的降解作用完成的。Cdc34途徑促使細(xì)胞從G1S期過(guò)渡：在G1期的早、中期，在DNA的復(fù)制起點(diǎn)就裝配了復(fù)制起始復(fù)合物，并且開(kāi)始了S期的CdkC組份的轉(zhuǎn)錄；但是，S期CdkC抑制物被G1 CdkC磷酸化而激活，激活的S期CdkC抑制物抑制了S期CdkC的活性，從而使細(xì)胞停留在G1期。在G1期的后期, Cdc34誘導(dǎo)S期Cdk抑制物的降解, 釋放出有活性的S期Cdk復(fù)合物,這種復(fù)合物能夠激發(fā)細(xì)胞進(jìn)入S期。一旦S期Cdk的降解作用被激活, S-期Cd

45、k復(fù)合物將與DNA形成預(yù)復(fù)制復(fù)合物中的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)位點(diǎn)磷酸化,預(yù)復(fù)制起始復(fù)合物是G1期在DNA復(fù)制起點(diǎn)上裝配的復(fù)合物。這些被S-期Cdk復(fù)合物磷酸化的蛋白質(zhì)不僅能夠激活DNA復(fù)制起始, 還能夠阻止新的預(yù)復(fù)制復(fù)合物的裝配。由于這種抑制作用, 每條染色體在細(xì)胞周期中只復(fù)制一次, 保證了合適的分配到子細(xì)胞中的染色體數(shù)。有絲分裂Cdk復(fù)合物是在S期和G2期合成的, 但是它們的活性一直受到抑制直到DNA合成完畢。一旦被激活, 有絲分裂Cdk復(fù)合物就會(huì)誘導(dǎo)染色體凝聚、核膜解體、有絲分裂器的裝配以及凝聚的染色體在中期赤道板上排列。在所有凝聚的染色體都與適當(dāng)?shù)募忓N體微管結(jié)合之后,有絲分裂Cdk復(fù)合物激活后期啟

46、動(dòng)復(fù)合物(anaphase promoting complex, APC)。這種多蛋白的復(fù)合物指導(dǎo)后期抑制物通過(guò)遍在蛋白介導(dǎo)的蛋白酶解作用進(jìn)行降解, 導(dǎo)致在中期將姐妹染色單體結(jié)合在一起的蛋白復(fù)合物失活。因此這些抑制物的降解作用, 允許有絲分裂進(jìn)入到后期。在后期末, APC也可指導(dǎo)有絲分裂周期蛋白的蛋白酶體的降解。有絲分裂Cdk活性的降低, 使得分離的姐妹染色單體去凝聚、核膜重新形成、在胞質(zhì)分裂中細(xì)胞質(zhì)的分裂, 最后形成子細(xì)胞。)12.2.3 裂殖酵母的細(xì)胞周期調(diào)控裂殖酵母是低等真核生物, 有完整的細(xì)胞周期(圖12-12), 通過(guò)對(duì)裂殖酵母(S.pombe)的研究, 對(duì)細(xì)胞周期的控制有了更深的了

47、解。圖12-12 裂殖酵母的細(xì)胞周期  酵母的細(xì)胞周期基因突變裂殖酵母是研究細(xì)胞周期的極好材料, 因?yàn)榻湍钢信c細(xì)胞周期相關(guān)基因的突變很容易被識(shí)別: 如細(xì)胞的溫度敏感突變, 如果是非允許范圍內(nèi)的溫度敏感突變, 就會(huì)影響細(xì)胞的長(zhǎng)度。已經(jīng)分離很多這種與細(xì)胞周期相關(guān)的溫度敏感突變型, 可分成兩類：一類是cdc突變, 這類突變?cè)诜窃试S的溫度下培養(yǎng), 會(huì)滯留在細(xì)胞周期的某個(gè)階段, 結(jié)果會(huì)形成特別長(zhǎng)的細(xì)胞, 因?yàn)檫@種突變不能進(jìn)入有絲分裂，滯留在間期, 所以能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。另一類稱為wee突變, 這種突變長(zhǎng)得特別小而不能分裂。 裂殖酵母cdc基因突變裂殖酵母中幾個(gè)溫度敏感的cdc基因的隱性突變使得裂殖

48、酵母在周期中不能進(jìn)入M期,由于生長(zhǎng)沒(méi)有停止, 所以比正常的酵母長(zhǎng)很多(圖12-13)。這些基因中的一個(gè)顯性突變, 命名為cdc2,使得酵母出現(xiàn)wee表型。一般來(lái)說(shuō), 隱形表型是因?yàn)槿鄙僖吧偷墓δ艿鞍姿? 而顯性表型是因?yàn)樵黾恿艘恍┑鞍坠δ?導(dǎo)致調(diào)節(jié)失常。圖12-13 裂殖酵母cdc2突變的表型cdc2+是野生型, 正常分裂; cdc2-是隱性突變, 產(chǎn)生特長(zhǎng)的表型, cdcD是顯性突變, 產(chǎn)生wee表型,即因細(xì)胞特小不能分裂。對(duì)分離的突變體的研究發(fā)現(xiàn), 沒(méi)有Cdc2的活性,細(xì)胞不能進(jìn)入有絲分裂。這表明Cdc2是裂殖酵母進(jìn)入有絲分裂的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。通過(guò)基因工程克隆到cdc2-基因, 序列

49、分析表明該基因編碼一個(gè)分子量為34kDa的蛋白, 與真核生物的蛋白激酶同源, 該Cdc2蛋白又稱為p34cdc2 蛋白。 裂殖酵母的MPF后來(lái)從裂殖酵母中分離了另一個(gè)cdc基因, 命名為cdc13+,該基因的產(chǎn)物也是裂殖酵母進(jìn)入有絲分裂必需的；序列分析表明該基因編碼的蛋白質(zhì)與非洲爪蟾和海膽的周期蛋白B同源。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cdc13和Cdc2蛋白能夠形成異質(zhì)二聚體, 并且具有蛋白激酶的活性。另外還發(fā)現(xiàn)這種蛋白激酶的活性隨裂殖酵母的周期變化而變化, Cdc13的濃度也隨Cdc2的活性波動(dòng)而波動(dòng)。這些結(jié)構(gòu)表明, 裂殖酵母的Cdc2-Cdc13相當(dāng)于非洲爪蟾的MPF。裂殖酵母的MPF的化學(xué)本質(zhì)是什么？

50、是如何發(fā)現(xiàn)的？(裂殖酵母的MPF的化學(xué)本質(zhì)是什么？是如何發(fā)現(xiàn)的？（答案） 答: 裂殖酵母油MPF是一種復(fù)合物，由Cdc2和Cdc13兩種蛋白組成，其中Cdc2是一種蛋白激酶，Cdc13是周期蛋白。主要是通過(guò)對(duì)裂殖酵母溫度敏感突變的研究發(fā)現(xiàn)了編碼這兩種蛋白的基因。裂殖酵母中幾個(gè)溫度敏感的cdc基因的隱性突變使得裂殖酵母在周期中不能進(jìn)入M期,由于生長(zhǎng)沒(méi)有停止, 所以比正常的酵母長(zhǎng)很多。這些基因中的一個(gè)顯性突變, 命名為cdc2,使得酵母出現(xiàn)wee表型（小而不分裂）。一般來(lái)說(shuō), 隱形表型是因?yàn)槿鄙僖吧偷墓δ艿鞍姿? 而顯性表型是因?yàn)樵黾恿艘恍┑鞍坠δ?導(dǎo)致調(diào)節(jié)失常。對(duì)分離的突變體的研究發(fā)現(xiàn), 沒(méi)

51、有Cdc2的活性,細(xì)胞不能進(jìn)入有絲分裂。這表明Cdc2是裂殖酵母進(jìn)入有絲分裂的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。通過(guò)基因工程克隆到cdc2-基因, 序列分析表明該基因編碼一個(gè)分子量為34kDa的蛋白, 與真核生物的蛋白激酶同源, 該蛋白又稱為p34cdc2 蛋白。后來(lái)從裂殖酵母中分離了另一個(gè)cdc基因, 命名為cdc13+,該基因的產(chǎn)物也是裂殖酵母進(jìn)入有絲分裂必需的；序列分析表明該基因編碼的蛋白質(zhì)與非洲爪蟾和海膽的周期蛋白B同源。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Cdc13和Cdc2蛋白能夠形成異質(zhì)二聚體, 并且具有蛋白激酶的活性。另外還發(fā)現(xiàn)這種蛋白激酶的活性隨裂殖酵母的周期變化而變化, Cdc13的濃度也隨Cdc2的活性波動(dòng)而

52、波動(dòng)。這些結(jié)構(gòu)表明, 裂殖酵母的Cdc2-Cdc13相當(dāng)于非洲爪蟾的MPF。)  裂殖酵母的MPF活性調(diào)節(jié) cdc25和wee1基因的突變對(duì)裂殖酵母表型和MPF活性的影響通過(guò)對(duì)其他一些cdc和wee突變體的研究, 發(fā)現(xiàn)裂殖酵母的MPF的活性受其他一些基因編碼產(chǎn)物的影響。如溫度敏感突變體cdc25-在非允許的溫度下也不能進(jìn)入有絲分裂, 另一方面, Cdc25的超表達(dá),將會(huì)縮短G2期,使未成熟的酵母提前進(jìn)入有絲分裂期。另一種突變體wee1- 也會(huì)造成酵母體積不夠大就提前進(jìn)入有絲分裂, 而Wee1蛋白的過(guò)量表達(dá)則延長(zhǎng)G2期,形成長(zhǎng)的酵母細(xì)胞( 圖12-14)。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn), 推測(cè)Cdc25

53、蛋白激活裂殖酵母的MPF的活性, 而Wee1蛋白抑制裂殖酵母的MPF活性。圖12-14 cdc25和wee1基因的突變對(duì)裂殖酵母表型和MPF活性的影響(a) Cdc25缺少或Wee1活性的細(xì)胞產(chǎn)生相反的表型;(b)Cdc25和Wee1對(duì)裂殖酵母MPF活性的影響。 裂殖酵母中MPF活性的調(diào)節(jié)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)裂殖酵母MPF的活性調(diào)節(jié)是相當(dāng)復(fù)雜的, 涉及多種蛋白激酶以及Cdc2亞基上兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化與去磷酸化（圖12-15）。圖12-15 裂殖酵母中MPF活性調(diào)節(jié)裂殖酵母中MPF活性的活性是如何調(diào)節(jié)的？(裂殖酵母中MPF活性的活性是如何調(diào)節(jié)的？（答案） 答: 裂殖酵母MPF的活性調(diào)節(jié)是相當(dāng)復(fù)雜的,

54、涉及多種蛋白激酶以及Cdc2亞基上兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化與去磷酸化。p34cdc2蛋白單亞基上有兩個(gè)磷酸化的位點(diǎn), 一個(gè)是激活型的磷酸化位點(diǎn), 另一個(gè)是抑制型的磷酸化位點(diǎn)。獨(dú)立存在的p34cdc2 蛋白激酶是無(wú)活性的, 同周期蛋白Cdc13結(jié)合后,仍然沒(méi)有活性, 但此時(shí)的復(fù)合物成為兩種蛋白激酶的底物, 一種是Weel激酶, 它使p34cdc2亞基上的抑制位點(diǎn)Tyr-15位殘基磷酸化, 抑制MPF的活性。第二種蛋白激酶是Cdc2激活蛋白激酶(Cdc2-activating kinase, CAK), 可以使Cdc2亞基中激活型的位點(diǎn)Thr-161(T-161)殘基磷酸化, 這種磷酸化最大限度地激活了M

55、PF的活性, 但是, 只要Tyr-15(Y-15)位殘基是磷酸化的,Cdc2-周期蛋白復(fù)合物就沒(méi)有活性。這種無(wú)活性的MPF稱為前MPF(Pre-MPF)。要使MPF具有活性，需要Cdc25蛋白的作用, 該蛋白具有蛋白磷酸酶的活性,能夠?qū)⒗野彼釟埢系牧姿峄鶊F(tuán)去除從而將MPF激活, 誘導(dǎo)細(xì)胞從G2進(jìn)入M期。不過(guò)，Wee1和Cdc25是相互競(jìng)爭(zhēng)的，如果細(xì)胞生長(zhǎng)得不夠大，Wee1的活性就強(qiáng)，有利于MPF的磷酸化，若細(xì)胞生長(zhǎng)得夠大，就有利于脫磷酸，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入M期。)12.2.4 芽殖酵母的細(xì)胞周期調(diào)控芽殖酵母(S.cerevisiae)是以出芽的方式進(jìn)行增殖的(圖12-16)。 圖12-16 芽殖酵

56、母的出芽 (a)處于細(xì)胞周期不同階段的出芽酵母的電鏡照片; (b)芽殖酵母細(xì)胞周期的主要過(guò)程。通過(guò)出芽形成的子細(xì)胞比母細(xì)胞小得多, 它必須長(zhǎng)到足夠大才能進(jìn)行分裂。當(dāng)芽殖酵母在G1期生長(zhǎng)到足夠大時(shí)（到達(dá)某一點(diǎn)）, 一些可導(dǎo)致進(jìn)入S期的基因進(jìn)行程序表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入S期。通常將芽殖酵母在G1期發(fā)動(dòng)細(xì)胞周期的點(diǎn)稱為起點(diǎn)(START)。  芽殖酵母的Cdc28蛋白(Cdc 28 protein)在芽殖酵母中有一個(gè)基因命名為CDC28, 編碼Cdc28蛋白, 該基因的功能相當(dāng)于裂殖酵母的CDC2。 S期促進(jìn)因子(S phase-promoting factor,SPF)芽殖酵母含有S期促進(jìn)因子,

57、 它能夠?qū)NA合成所需的蛋白質(zhì)磷酸化并進(jìn)行調(diào)節(jié)。與MPF相似的是, SPF也是異質(zhì)二聚體, 一個(gè)是Cdc28, 另一個(gè)是在G1期起作用的周期蛋白。芽殖酵母中有三種G1周期蛋白:Cln1、Cln2和Cln3。前兩個(gè)主要在突變體中起作用，是通過(guò)溫度敏感突變發(fā)現(xiàn)的，最后一個(gè)在野生型細(xì)胞中起作用。請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)分離芽殖酵母G1周期蛋白，并說(shuō)明其原理。(請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)分離芽殖酵母G1周期蛋白，并說(shuō)明其原理。（答案） 播放動(dòng)畫 答: 為了鑒定芽殖酵母的G1期周期蛋白，首先要獲得芽殖酵母cdc28基因的溫度敏感突變體, 這樣，當(dāng)該G1周期蛋白基因高水平表達(dá)時(shí), 能夠抑制某些溫度敏感性cdc28突變體。這種

58、方法的基本原理是:某些cdc28突變體可以是溫度敏感的, 這樣, 在非允許溫度下突變的Cdc28蛋白與G1周期蛋白的親和力就低。在這種情況下, 如果G1周期蛋白的濃度足夠高, 它能夠與突變的Cdc28蛋白形成足夠的SPF,促使細(xì)胞在非允許溫度下進(jìn)入S期。科學(xué)家通過(guò)基因工程手段分離到兩個(gè)G1周期蛋白基因:CLN1和CLN2, 它們能夠按預(yù)測(cè)的方式抑制cdc28突變(圖12-17)。后來(lái), 科學(xué)家用又分離鑒定了一個(gè)顯性的G1周期蛋白基因: CLN3,是在野生型細(xì)胞中起作用的周期蛋白基因。(a) 野生型細(xì)胞能夠產(chǎn)生高親和力的Cdc28蛋白, 這種蛋白在25和36下與G1周期蛋白結(jié)合形成SPF。(b) 某些cdc28ts突變體表達(dá)的Cdc28蛋白與G1周期蛋白的親和力低, 在允許溫度(25)能夠形成足夠的Cdc28ts-G1周期蛋白(SPF),能把生長(zhǎng)并形成菌落; 但是在非允許溫度(36),不會(huì)形成SPF,不會(huì)形成菌落。(c)用從芽殖酵母基因庫(kù)的高拷貝克隆載體轉(zhuǎn)化cdc28ts 細(xì)胞