甲氨蝶呤中3種雜質(zhì)的合成

1、甲氨蝶呤中3種雜質(zhì)的合成鄭君軍1基金項(xiàng)目 國家“重大新藥創(chuàng)制” 科技重大專項(xiàng)（2009ZX09313）；衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（200802038）作者簡介 鄭君軍，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锖铣?。?lián)系電話E-mail：zhengjunjun。通訊作者 高烏恩，女，教授，研究方向?yàn)樾滤幯芯颗c開發(fā)。聯(lián)系電話E-mail：gaowuen。吳松，男，研究員，研究方向?yàn)樾滤幯芯颗c開發(fā)。聯(lián)系電話： （010）83163542，E-mail：ws。，王冬梅2，吳彩勝2，張金蘭2，高烏恩1*，吳 松2*（1 內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059；2 中國

2、醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050）摘要 目的:合成甲氨蝶呤原料藥中3種主要雜質(zhì)。方法:以對甲氨基苯甲酸、2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽與1,1,3-三溴丙酮為原料，環(huán)化合成雜質(zhì)E，再水解合成雜質(zhì)D，甲氨蝶呤水解獲得雜質(zhì)C。結(jié)果:所合成3種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)經(jīng)氫譜（1H-NMR）和質(zhì)譜（MS）確證，純度經(jīng)HPLC檢測可達(dá)98.7%以上。結(jié)論:合成了甲氨蝶呤中的3種雜質(zhì)，可作為甲氨蝶呤原料藥質(zhì)量控制的雜質(zhì)對照品。關(guān)鍵詞 甲氨蝶呤；抗腫瘤藥；雜質(zhì)；合成中圖分類號 R914.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1003-3734Synthesis of three impurities of

3、 methotrexateZHENG Jun-jun1, WANG Dong-mei2, WU Cai-sheng2, ZHANG Jin-Lan2, GAO Wu-en1*, WU Song2*（1 Inner Mongolla Medical college, Hohhot 010059, China;2 Institute of Materia Mdica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Uion Medical College, Beijing 100050, China) Abstract Objective: To

4、 synthesize three impurities of methotrexate (impurity E, impurity D and impurity C). Methods: Use 4-(methylamino)benzoicacid, 2,4,5,6-tetraminopyrimidine sulfate and 1，1，3-tribromoacetone as starting materials to prepare impurity E and synthesize impurity D by hydrolyzing E, impurities C was obtain

5、ed by hydrolyzing methotrexate. Results: The structures of all impurities, whose purity were over 98.7% (detected by HPLC), were verified by 1H-NMR and MS. Conclusion: The synthetic compounds can be used as the reference substance of the impurities in the quality control of methotrexate.Key words me

6、thotrexate; antineoplastic drug; impurity; synthesis甲氨蝶呤(methotrexate，圖1)化學(xué)名為N-4-N-(2，4-二氨基-6-蝶啶基甲基)甲基氨基苯甲酰-L-谷氨酸，臨床上用作抗腫瘤藥物和免疫抑制劑等，但可能發(fā)生多種不良反應(yīng)，如胃腸道反應(yīng)、肝腎功能損傷、肺炎或肺纖維化、骨髓抑制等，這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生，很可能與其含有的雜質(zhì)有關(guān)。2007年7月上海華聯(lián)藥廠“甲氨蝶呤事故”引起了社會各界的廣泛關(guān)注1 ，因此，甲氨蝶呤雜質(zhì)對照品對于甲氨蝶呤原料藥中雜質(zhì)的準(zhǔn)確定性和定量控制及保證甲氨蝶呤的藥品質(zhì)量具有重要意義。圖1 甲氨蝶呤結(jié)構(gòu)中國藥典201

7、0年版2只將甲氨蝶呤的異構(gòu)體R-甲氨蝶呤作為雜質(zhì)對照品收錄，我們在對甲氨蝶呤原料藥進(jìn)行HPLC-MS分析時，發(fā)現(xiàn)其中還存在另外3種含量較多的雜質(zhì)成分。參照歐洲藥典3，分別將這3種雜質(zhì)命名為雜質(zhì)E、雜質(zhì)D和雜質(zhì)C（圖2）。為進(jìn)一步控制產(chǎn)品質(zhì)量，為甲氨喋呤的質(zhì)量控制提供雜質(zhì)對照品的標(biāo)準(zhǔn)化合物，我們首次報道用化學(xué)方法合成上述3種雜質(zhì)，以期解決甲氨蝶呤質(zhì)量控制所需雜質(zhì)對照品的來源問題。 圖2 雜質(zhì)E、雜質(zhì)D和雜質(zhì)C的結(jié)構(gòu)文獻(xiàn)報道的甲氨蝶呤合成方法可分為兩類4-10： 一鍋合成法，即對-甲氨基苯甲酰谷氨酸、四氨基嘧啶硫酸鹽或鹽酸鹽與1,1,3-三溴丙酮直接一步合成甲氨蝶呤。 分步合成法，先通過四氨基嘧啶

8、硫酸鹽或鹽酸鹽與1,3-二羥基丙酮或二溴丙醛或丙酮醛的反應(yīng)獲得6-溴甲基-2,4-二氨基蝶啶，再與對甲氨基苯甲酰谷氨酸反應(yīng)制得甲氨蝶呤。因此我們參照甲氨蝶呤的合成方法 10-13，設(shè)計(jì)以對甲氨基苯甲酸和2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽及1,1,3-三溴丙酮為原料，酸性條件下環(huán)合生成雜質(zhì)E，再由雜質(zhì)E水解合成雜質(zhì)D；雜質(zhì)C由甲氨蝶呤水解而得（合成路線見圖3）。圖3 甲氨蝶呤中雜質(zhì)E、雜質(zhì)D和雜質(zhì)C的合成路線實(shí)驗(yàn)部分1 儀器與試劑甲氨蝶呤、1,1,3-三溴丙酮、2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽（南京天尊澤眾化學(xué)有限公司）；對甲氨基苯甲酸(Alfa Aesar化學(xué)有限公司)；氫氧化鈉、乙醇、甲醇、丙

9、酮、濃鹽酸、濃硫酸、氨水、氯化鋅(北京化工廠，化學(xué)純)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(保定市高新區(qū)陽光科教儀器廠)；LABOROTA-4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國HeidolAr公司)；核磁共振儀（Varian Mercury 300 MHz，DMSO溶劑）；LC/MSD TOF型液-質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent），熔點(diǎn)由 YRT 3熔點(diǎn)儀（天津大學(xué)精密儀器廠）測定，溫度未校正。2 實(shí)驗(yàn)方法2.1 雜質(zhì)E的制備 將甲氨基苯甲酸9.07 g（0.06 mol）置于500 mL的三頸瓶中，在攪拌的條件下加入100 mL氫氧化鈉的甲醇水溶液（氫氧化鈉2.40 g，0.06 mol；甲醇:水=1:

10、1），使對甲氨基苯甲酸充分溶解。待溶解后加入氯化鋅4.08 g（0.03 mol），即得白色懸濁液，制得鋅鹽直接用于下步反應(yīng)。將2,4,5,6-四氨基嘧啶硫酸鹽21.44 g (0.09 mol）加入上述鋅鹽三頸燒瓶中，加水66 mL，攪拌溶解，加熱到50，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 至2。取30 mL 1,1,3-三溴丙酮(26.53 g, 0.09 mol）的乙醇溶液，滴加15 mL到反應(yīng)液中，同時不斷加入20氫氧化鈉并保持pH為2，溫度保持在50。15 min后滴加剩余的1,1,3-三溴丙酮乙醇溶液，攪拌3.5 h。將反應(yīng)液冷卻到3040，邊攪拌邊加入氨水(70 mL)，調(diào)節(jié)pH 至9.5，保持溫

11、度低于40，室溫?cái)嚢?5 min。加入硅藻土（10 g），攪拌15 min。過濾，水洗，棄去濾餅。室溫下濃鹽酸調(diào)節(jié)濾液的pH至6，有固體析出，過濾，水洗。將濾出物重新用水（100 mL）溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1.5，繼續(xù)攪拌1.5 h，過濾析出固體物，水洗；按上述方法重新結(jié)晶1次。將結(jié)晶固體用少量水溶解，加20%氫氧化鈉調(diào)pH至10，攪拌下先加入少量丙酮，使形成懸液狀，再加入大量丙酮（300 mL）稀釋。室溫?cái)嚢? h，過濾，丙酮洗滌，減壓干燥，得黃色固體。將黃色固體溶于水（95 mL）中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4左右，有固體析出，過濾，依次用水，丙酮和乙醇洗滌，減壓干燥，得黃色固體雜質(zhì)E（1

12、0.57 g， 36.14%），經(jīng)HPLC測定，純度為98.7%，檢測條件同歐洲藥典3，mp 207209。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6） ：3.24 (s, 3H, N-CH3), 4.82 (s, 2H, CH2), 6.84 (d, J = 8.7, 2H, ArH), 6.98 (brs, 2H, NH2), 7.13 (s, 2H, NH2), 7.74 (d, J = 8.7, 2H, ArH) , 8.63 (s, 1H, ArH )。ESI-MS m/z: 326M+H +。2.2 雜質(zhì)D的制備 將固體雜質(zhì) E（3.25 g，0.01 mol）置于500 mL

13、三頸瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入150 mL氫氧化鈉水溶液（1 mol·L -1）回流2 h后停止反應(yīng)，用1 mol·L -1的鹽酸調(diào)pH至4.5，待析出固體，加入200 mL丙酮使其充分析出，過濾，水洗，得到淡黃色固體雜質(zhì)D（3.20 g，98.2%），經(jīng)HPLC測定，純度為98.8%，檢測條件同歐洲藥典， mp 226228。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6） ：3.18 (s, 3H, N-CH3), 4.78 (s, 2H, CH2), 6.77 (d, J = 8.1, 2H, ArH), 7.09 (brs, 2H, NH2), 7.71 (d, J =

14、 8.1, 2H, ArH), 8.48 (s, 1H, ArH ), 11.68 (s, 1H, OH), 12.15 (brs, 1H, CO2H)。ESI-MS m/z:327M+H +。2.3 雜質(zhì)C的制備 將甲氨蝶呤（4.54 g，0.01 mol）置于500 mL三頸瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入150 mL氫氧化鈉水溶液（1 mol·L -1）回流0.5 h后停止反應(yīng)，用1 mol·L -1的鹽酸調(diào)pH 至4.5，待析出固體，加入200 ml丙酮使其充分析出，過濾，水洗，得到淡黃色固體雜質(zhì)C（4.50 g，99.1%），經(jīng)HPLC測定，純度為98.7%，檢測條件同歐洲

15、藥典3，mp 223225。1H-NMR（300 MHz, DMSO-d6）：1.902.03 ( dd, J = 5.4, J = 7.2, 2H, CH2), 2.30 (t, J = 5.4, 2H, CH2), 3.18 (s, 3H, N-CH3), 4.224.36 (m, 1H, CH), 4.78 (s, 2H, CH2), 6.80 (d, J = 7.8, 2H, ArH), 6.90 (brs, 2H, NH2), 7.71 (d, J = 8.1, 2H, ArH), 8.20 (d, J = 6.9, 1H, NH), 8.48 (s, 1H, ArH), 11.59

16、(brs, 1H, OH), 12.28 (brs, 2H, 2×CO2H)。ESI-MS m/z:456M+H +,478M+Na +。討 論在合成雜質(zhì)E時，pH對化合物的生成影響較大。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH低于或高于2時，都會影響雜質(zhì)E的收率。據(jù)文獻(xiàn)報道14，在pH為2時，反應(yīng)過程中的中間體6-溴甲基蝶呤（圖4）溶解性最好，而整個反應(yīng)過程中有氫溴酸產(chǎn)生，將影響6-溴甲基蝶呤的溶解，進(jìn)而影響產(chǎn)率，所以需嚴(yán)格控制pH值；同時，我們在雜質(zhì)D和雜質(zhì)C的后處理時發(fā)現(xiàn)，在調(diào)節(jié)pH值至4.5時，只形成了乳濁液，沒有得到固體，繼續(xù)降低pH值也不能形成固體，我們根據(jù)甲氨蝶呤的性質(zhì)，選用丙酮使乳濁液固化，

17、最終得到了雜質(zhì)D和雜質(zhì)C的固體。圖4 6-溴甲基蝶呤研究中還發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)C是甲氨蝶呤的降解產(chǎn)物，在生產(chǎn)、運(yùn)輸過程都可能產(chǎn)生，尤其在制劑中其含量隨甲氨蝶呤儲存時間的延長而增高，是甲氨蝶呤中需重點(diǎn)關(guān)注的雜質(zhì)。對合成出的3種雜質(zhì)對照品進(jìn)行了HPLC測定，按面積歸一化法計(jì)算均大于98.7%，可以作為甲氨蝶呤的雜質(zhì)質(zhì)量控制的對照品。參考文獻(xiàn)1 魏銘言.“甲氨蝶呤”事件經(jīng)過 N.新京報，2007-12-13（A19）.2 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010版（二部）M. 中國醫(yī)藥科技出版社，2010：149-150.3 European Pharmacopoeia Commission. The

18、European Pharmacopoeia 5.0 Edition M. The Stationery Office, 2005: 2011-2013.4 DORIS RS, DONNA BC, JAMES MS, et al. Analogs of Pteroylglutamic Acid. III. 4-Amino DerivativesJ. J Am Chem Soc, 1949, 71 (5): 1753- 1758.5 姚其正，張志祥，唐鋒等.抗腫瘤藥甲氨蝶呤衍生物及其在藥學(xué)上的用途:CN,1439641AP. 2003-09-03.6 劉毅,陳文政.甲氨蝶呤的合成工藝J.中國醫(yī)藥

19、工業(yè)雜志，1991，22(11)：520-523.7 ANDREW HT, MARY S, DIEM DC. Synthesis of multi-13C-enriched methotrexate for NMR studies of drug-enzyme interactionsJ. Heterocycles, 1987, 25(1): 507-514.8 JENSEN JK, ALSTER K. Method for preparing N-(4-(2,4-diamino-6-pteridinyl)-methyl) methyl-amino)benzoyl)glutamic acid:EP, 0048001P