深圳地區(qū)HIV-1流行毒株的env基因序列測(cè)定和亞型分析

1、    深圳地區(qū)HIV-1流行毒株的env基因 序列測(cè)定和亞型分析        【摘要】目的了解深圳地區(qū)HIV-1各亞型毒株的流行情況和傳播方式。方法用套式-聚合酶鏈反應(yīng)(nested-PCR)對(duì)5份在深圳市發(fā)現(xiàn)的HIV-1感染者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的HIV-1膜蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)C2-V3及其鄰區(qū)350-450個(gè)核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定和分析。結(jié)果5份樣品中存在B和E兩種亞型的HIV-1毒株序列，其中B亞型2份，彼此間的基因離散率為10.2%；E亞型3份

2、，彼此間的基因離散率為2.7%。B亞型株與歐美B亞型毒株序列十分接近，E亞型株與泰國E亞型共享序列非常相似。結(jié)論深圳地區(qū)HIV-1 B亞型為經(jīng)性途徑由境外傳入，HIV-1 E亞型經(jīng)血途徑在靜脈吸毒者及部分獻(xiàn)血員中傳播?！娟P(guān)鍵詞】人類免疫缺陷病毒-1基因變異序列分析 Subtype and sequence analysis of the C2-V3 region of gp120 genes among HIV-1 strains in ShenzhenFeng Tiejian,Shao Yiming,Li Liangcheng,et al.Shenzhen Health and Anti-e

3、pidemic Station,Shenzhen 518020【Abstract】ObjectiveTo study the prevalence status and transmission patterns of various subtypes of HIV-1 in Shenzhen.MethodsHIV-1 env gene was amplified by PCR from uncultured peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from 5 HIV-1 seropositive infectors of Sh

4、enzhen in 1996.The C2-V3 region (about 450bp) of them was sequenced.ResultsThere are two HIV-1 subtypes,B and E with 10.2% and 2.7% gene divergence inside each subtype.The 2 subtypes were closely related to the type B in Europe and America.Meanwhile,the 3 subtypes of E strains were most close to the

5、 international subtype E.ConclusionThis study and epidemiology references showed that the subtype B was transmitted by sex and the subtype E was transmitted by drug users as well as blood donors in Shenzhen.【Key words】HIV-1Gene variationSequence analysisHIV是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，由于其逆轉(zhuǎn)錄酶在HIV復(fù)制過程中缺乏“自身校正”作用；以及同型或不同

6、型毒株HIV間重組導(dǎo)致HIV基因高度變異，且隨流行時(shí)間的延長和變異程度的不斷增大而產(chǎn)生新的亞型。根據(jù)HIV基因組中變異性最大的膜蛋白(env)基因核苷酸和氨基酸序列的同源性，目前已確定的HIV亞型至少有十個(gè)即從AI和O亞型。不同亞型的生物學(xué)特性、經(jīng)不同途徑或在不同人群中的傳播效率有所差異，并具有一定的地區(qū)性分布特點(diǎn)14。為了掌握我市HIV-1毒株在不同人群中流行傳播情況，分析其變異特點(diǎn)和傳染來源，我們于1996年采集部分HIV-1感染者血樣，對(duì)其env基因C2-V3區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定和分析。材料和方法一、標(biāo)本來源5例均為深圳市HIV-1抗體陽性者，每例采集靜脈血35ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液

7、分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，PBS洗兩遍后，加入0.5ml裂解緩沖液(0.1mmol Tris HCl,pH8.3,10mmol EDTA,10mmol NaCl,0.5% SDS,200g/ml蛋白酶-K)混勻，55溫育2小時(shí)后，9515分鐘滅活蛋白酶-K。用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀物經(jīng)真空干燥后，加入100l無菌去離子水溶解，-20保存。二、聚合酶鏈反應(yīng)按nested-PCR方法，設(shè)計(jì)合成多對(duì)PCR引物(表1)，擴(kuò)增HIV-1 env基因。以env-L/env-i為外側(cè)引物，進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，條件為：951分鐘變性；9430秒，5530秒，72120秒，30個(gè)循環(huán)；7210分鐘。取

8、十分之一PCR產(chǎn)物，以env-C/env-k為內(nèi)側(cè)引物，按上述條件進(jìn)行第二次PCR，擴(kuò)增env基因C2-V3區(qū)。表1PCR引物序列引物序列(5-3)在env基因 中的定位env-LTGGGGTACCTGTGTGGAAA192env-iTATCCCTGCCTAACTCTATT2056env-kGCCCATAGTGCTTCCTGCTGCTCC1536env-CCCAATTCCCATACATTATTG607env-D3CTGTTAAATGGCAGTCTAGCAG782env-f2GTGGAGGGGAATTTTTCTACTG1109     三、PCR產(chǎn)物的純化

9、PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，與分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照判斷無誤后，切下特異擴(kuò)增帶，用Qiaegen公司的Qiaex試劑，按說明提純擴(kuò)增的HIV-1 DNA片段?；厥盏玫腄NA溶于10mmol Tris-HCl,pH8.7，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較估算核酸濃度。四、核苷酸序列測(cè)定分別使用env-D3和env-f2為測(cè)序引物，以提純的PCR產(chǎn)物為模板，用ABI公司熒光標(biāo)記末端終止物循環(huán)測(cè)序試劑盒，在PE公司9600型PCR儀上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，模板用量約1g，引物用量為6pmol。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)提純后用自動(dòng)DNA序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定。五、序列分析測(cè)得的序列用SeqEd和DNA軟件進(jìn)行編輯校正，每個(gè)樣品

10、C2-V3區(qū)核苷酸的最終序列根據(jù)兩個(gè)同向測(cè)序引物所測(cè)結(jié)果重疊校核后確定。序列的排列、比較和同源性等分析，使用威斯康星GCG公司軟件包完成，具體包括：(一) 用pileup程序?qū)悠芳皣H標(biāo)準(zhǔn)序列的排列和比較；(二) 用Pretty程序計(jì)算一組序列的共享序列(consensus sequence)；(三) 用distances計(jì)算一組序列間的基因離散率；(四) 用groutree程序做系統(tǒng)樹(phylogenetic tree)分析。 結(jié)果一、深圳地區(qū)HIV-1毒株核酸序列與國際標(biāo)準(zhǔn)毒株的比較經(jīng)nested-PCR擴(kuò)增后，從5份HIV-1感染者PBMC樣品中獲得可用于序列測(cè)定的HIV-1 env

11、基因目的片段。將env-D3和env-f2引物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯整理后，測(cè)得C2-V3及其相鄰區(qū)的核苷酸序列。應(yīng)用pileup和pretty程序進(jìn)行有關(guān)排列和比較并計(jì)算出其共享序列(見附)，根據(jù)序列特征，5個(gè)毒株可分為兩組，第一組2個(gè)毒株(sz3、sz4)均來自性亂人員；第二組3個(gè)毒株，包括2名靜脈吸毒者(sz2、sz5)和1名獻(xiàn)血員(szld3)。二、深圳地區(qū)HIV-1毒株與AE國際亞型和部分參考毒株基因離散率比較將兩組毒株核苷酸序列與國際AE5個(gè)亞型的共享序列(Acon-Econ)及國內(nèi)部分B亞型代表株核苷酸序列進(jìn)行比較，計(jì)算彼此間的基因離散率(見表2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第一組2個(gè)毒株與A、C、D和

12、E亞型共享序列間的離散率均在22%以上，與主要代表歐美B亞型的Bcon間僅為7.5%，而與屬泰國B亞型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株間的離散率分別為11.1%，12.0%，12.2%，11.5%；第二組3個(gè)毒株與A、B、C、D國際亞型共享序列間和與屬泰國B亞型毒株的云南、湖北、河南、四川代表株間的離散率均在24%以上，與主要代表泰國E亞型的Econ間僅為6.2%。表2深圳HIV-1各亞型毒株與AE國際亞型和部分參考毒株基因離散率比較亞型基因離散率(<"x (1231 bytes)" src="/med/cano/201003/20100315200031

13、221" 34 13>%)本型內(nèi)AconBCconDconEconconyn-Bhub-Bhen-Bsc-BB10.222.5±0.17.5±0,711.1±0.312.0±0.912.2±0.211.5±0.222.9±1.922.6±0.624.7±3.1E2.724.1±1.724.5±1.124.4±1.125.2±0.827.1±0.925.4±0.827.6±1.830.7±1.96.2±

14、1.6     注：序列基因離散率是用GCG程序計(jì)算C2-V3區(qū)第165450核苷酸序列得到         附深圳地區(qū)HIV-1毒株的核酸序列及與國際標(biāo)準(zhǔn)毒株的比較三、深圳地區(qū)HVI-1流行毒株的系統(tǒng)樹分析系統(tǒng)樹分析顯示，第一組2個(gè)毒株與Bcon及YN-b、Hub-b、Hen-b、Sc-b等聚集在一起而遠(yuǎn)離其他國際亞型毒株序列；第二組3個(gè)毒株則與國際標(biāo)準(zhǔn)E亞型聚集在一起，但遠(yuǎn)離其他國際亞型毒株。討論對(duì)5例HIV-1感染者PBMC中HIV-1 env C2-V3及其鄰近區(qū)域序

15、列進(jìn)行分析比較后發(fā)現(xiàn)目前深圳至少存在B和E兩種亞型的HIV-1毒株流行。根據(jù)流行病學(xué)資料，從感染時(shí)間上看，第一組兩名歐美B亞型HIV-1感染者(sz3和sz4)的檢出時(shí)間分別為3個(gè)月和62個(gè)月，二者間的基因散離率為10.2%，第二組3名E亞型感染者的檢出時(shí)間約為35個(gè)月，彼此間的基因離散率為2.7%，其中2例靜脈吸毒者間的核苷酸序列幾乎完全相同。從與國際及我國其他省份流行毒株比較結(jié)果看，深圳HIV-1 B亞型毒株與我國云南等地流行的屬泰國B亞型毒株間的基因離散率較大，而與歐美B亞型毒株間關(guān)系密切。對(duì)毒株的gp120中最重要的中和抗體決定簇所在的V3環(huán)多肽序列進(jìn)行比較也支持此結(jié)論，2個(gè)B亞型毒株

16、均帶有GPGG這一歐美B亞型V3環(huán)頂端四肽序列特征，而不同于典型泰國B亞型V3環(huán)頂端所帶有的GPGQ四肽序列特征57。E亞型毒株均為典型的泰國E亞型。從感染者原籍地分布分析，5例感染者中僅1例(B亞型)為深圳居民，1992年在香港經(jīng)性接觸感染；另一例B亞型感染者為意大利人，1993年派駐中國工作，曾去過國內(nèi)多個(gè)城市及馬來西亞等東南亞國家，有復(fù)雜的性接觸史。3名E亞型感染者均系外地流動(dòng)人員，其中2名靜脈吸毒者分別來自黑龍江省和陜西省，于1996年34月份因共用針具吸毒而感染；另一名為有職業(yè)獻(xiàn)血史的河南人。根據(jù)以往的研究結(jié)果，E亞型毒株主要在性亂和靜脈吸毒人群中流行810，我國獻(xiàn)血員中流行的主要是

17、B亞型HIV-1毒株，其次為C亞型，目前尚未有E亞型流行的報(bào)告，該獻(xiàn)血員否認(rèn)吸毒史、冶游史和重大疾病史，這是否預(yù)示著E亞型毒株已在我國部分地區(qū)的獻(xiàn)血員中流行有待進(jìn)一步調(diào)查。我們的調(diào)查資料表明，歐美B亞型HIV-1毒株在較早以前即已通過性途徑由歸國人員和外國人傳入我市。深圳因鄰近HIV高流行區(qū)泰國等東南亞國家，而泰國HIV-1的流行在經(jīng)歷了主要?dú)W美B亞型向泰國B亞型的漂移后，近年又出現(xiàn)泰國E亞型在吸毒和性傳播人群中流行的趨勢(shì)，在我市吸毒的兩名HIV-1型感染者全部為泰國E亞型，說明深圳吸毒人群中E亞型HIV-1流行株很可能是從泰國傳入。作者單位：518020深圳市衛(wèi)生防疫站(馮鐵建，李良成，張順

18、祥)；中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院(邵一鳴，蘇玲，邢輝)參考文獻(xiàn)1Myers G, Korber S, Wain-Hobson RF,et al.Human Retroviruses and AIDS 1993.Los Alamos,New Mexico:Los Alamos National Laboratory;1993.2Weniger BG,Takebe Y,Ou CY,et al.The molecular epidemiology of HIV in Asia.AIDS,1994,8(suppl 2):S1-S14.3Janssons W.Genetic and phylogenetic a

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