貞草方對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用

1、貞草方對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用張藝寶 陳瑛 周晨 陸聆韻 蔣金波指導老師：徐列明（上海中醫(yī)藥大學03中醫(yī)臨床七年制，上海201203）摘要目的：研究貞草方（女貞子和甘草按3：2配伍）對小鼠CCl4急性肝損傷的保護作用。方法：將動物隨機分為正常組、CCl4模型組、女貞子組、甘草組、貞草方低劑量組、貞草方高劑量組，后4組先分別灌胃給與相應中藥6d，然后1次性腹腔注射CCl4。檢測血清中TBiL含量、ALT和AST活性，觀察肝組織病理變化。結(jié)果：所檢測的指標值中CCl4模型組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。各給藥組與模型組比較以及各給藥組之間比較，所檢測的指標值差異亦無統(tǒng)計學意

2、義(P0.05)。肝臟病理學觀察顯示各組小鼠肝損傷雖有一定程度的差異，但也不是十分明顯。結(jié)論：本次試驗造模不成功，未見貞草方對小鼠CCl4急性肝損傷具有十分明顯的保護作用。關(guān)鍵詞女貞子；甘草；急性肝損傷；生化指標；病理組織學女貞子(fructus ligustri lucidi)系木樨科常綠喬木女貞的干燥成熟果實，性味甘、微苦、涼，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎，明目烏發(fā)的功能1。甘草系豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）、脹果甘草（G inflate Bat）或光果甘草(Gglabra L)的干燥根及根莖，性味甘、平，歸心、肺、脾、胃經(jīng)，具有補脾益氣、清熱解毒、祛

3、痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效2。藥物配伍使用是中醫(yī)治療的特色，本試驗研究貞草方（女貞子和甘草按3：2配伍）對小鼠CCl4急性肝損傷3的保護作用。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物 ICR雄性小鼠72只，清潔級，體重1822g，購于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2003-0002，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。1.1.2 藥品 女貞子顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號0701171）每袋裝1g,相當于飲片10g。甘草顆粒劑（江陰天江藥業(yè)有限公司，批號0702015）每袋裝0.5g，相當于飲片3g。配制女貞子組溶液濃度為0.0252g/ml,相當于生藥濃度

4、0.252g/ml；甘草組溶液濃度為0.0280g/ml,相當于生藥濃度0.168g/ml；貞草方低劑量組溶液濃度為0.0532g/ml,相當于生藥濃度0.420g/ml；貞草方高劑量組溶液濃度為0.124g/ml,相當于生藥濃度0.980g/ml。1.1.3 試劑 CCl4（國藥集團化學試劑有限公司，批號20061114）、橄欖油(國藥集團化學試劑有限公司，批號F20040614)、甲醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號JH20060110）。1.1.4 儀器 自動生化分析儀、組織自動脫水機、組織包埋機、石蠟切片機、攤片機、烘片機、光學顯微鏡等。1.2 方法1.2.1 動物分組 將72只小鼠隨

5、機分為正常組、CCl4模型組、女貞子組、甘草組、貞草方低劑量組、貞草方高劑量組，每組12只。1.2.2 給藥方法 置溫度2022，濕度4850 的實驗室適應環(huán)境4d后試驗。自試驗之日起各中藥組小鼠每天給與相應的中藥灌胃1次，灌胃量0.25ml/10g體重，給藥量見表1。除貞草方高劑量組給藥量相當于成人常用量的70倍外，其他各組給藥量相當于成人常用量的30倍。正常組和CCl4模型組給予等量蒸餾水。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃6d。1.2.3 模型制備 末次給藥1h后，除正常組腹腔注射生理鹽水（10ml/kg體重)外，其余組均采用一次性腹腔注射CCl4（0.125%溶液，10ml/kg體重) 復制急性肝

6、損傷小鼠模型4。1.2.4 樣品的采集和處理 CCl4注射后1d稱小鼠體重，摘眼球取血，脊柱脫臼處死，稱肝臟重量，計算肝指數(shù)（肝指數(shù)肝臟重量/小鼠體重），留取血清和肝組織樣本作肝功能檢測和病理學觀察。1.2.5 肝功能檢測 以自動生化分析儀檢測血清ALT和AST活性以及TBiL含量。1.2.6 肝臟病理學觀察 留取約553 mm3相同部位的肝組織，10中性福爾馬林固定，逐級酒精脫水，石蠟包埋。切片厚4mm，作常規(guī)H-E染色，光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)、肝細胞變性壞死和炎癥細胞浸潤等病理變化。1.2.7 統(tǒng)計方法 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差(s)表示，計量資料用統(tǒng)計分析軟件SPSS12.0中的ANOVA程

7、序進行單因素方差分析，對于方差齊的數(shù)據(jù)采用SNK法檢驗，對于方差不齊的數(shù)據(jù)采用Games-Howell法檢驗，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 肝指數(shù)的變化 由表1可見，模型組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義，各給藥組與模型組比較，所檢測的指標值差異亦無統(tǒng)計學意義。表1 貞草方對小鼠肝指數(shù)的影響 組別 n 各組因灌胃 給藥量 相當于生藥量 肝指數(shù) （只）死亡數(shù)（只）（g/kg.b.w） （g/kg.b.w）正常組 7 5 - - 0.04910.00687 模型組 7 5 - - 0.04890.00390 女貞子組 5 7 0.63 6.30 0.04350.01030 甘草組 7

8、 5 0.70 4.20 0.04820.00502 低劑量組 7 5 1.33 10.50 0.04540.00509 高劑量組 9 3 3.10 24.50 0.04970.00499 2.2 血清TBiL、ALT、AST含量變化 由表2可見，模型組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義，各給藥組與模型組比較，所檢測的指標值差異亦無統(tǒng)計學意義。表2 貞草方對小鼠CCl4急性肝損傷的血清生化指標的影響 組別 n TBiL ALT AST (mmol/L) (IU/L) (IU/L)正常組 5 9.201.62 43.008.28 103.607.44模型組 5 7.722.03 52.0014.78

9、 138.5040.55 女貞子組 2 6.651.34 54.5010.61 181.005.66 甘草組 6 7.180.58 148.33100.87 223.33150.04 低劑量組 5 8.041.30 133.8081.34 140.2010.76高劑量組 5 8.680.73 45.0021.86 157.4063.44注：除去一組特異數(shù)據(jù)。該組樣本例數(shù)為6。2.3 肝臟病理改變正常組小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)正常，肝索排列規(guī)則，肝細胞形態(tài)無改變。模型組小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間界限不清，肝細胞有較廣泛的胞漿疏松，部分呈小泡狀脂肪變性；肝竇擴張，庫普佛細胞增生。與模型組相比，各用藥組小鼠肝

10、臟結(jié)構(gòu)改變較輕，變性肝細胞的程度和范圍也略低，肝竇有不同程度的擴張，其中甘草組和貞草方高劑量組小鼠的肝竇充血較明顯，見圖1。 正常組 模型組 女貞子組 甘草組 貞草方低劑量組 貞草方高劑量組 圖1 小鼠的肝臟病理改變(HE，X200)3 討論3.1 CCl4致小鼠急性肝損傷的原理與檢測指標 CCl4是一種典型的肝臟毒物，CCl4經(jīng)肝臟微粒體細胞色素P-450激活后，產(chǎn)生活潑的三氯甲基自由基(CCl3)，三氯甲基自由基可攻擊肝細胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過氧化反應，并可與肝細胞微粒體脂質(zhì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價結(jié)合，損傷細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，從而使肝臟的可溶性酶的活性提高。并且CCl4可以抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣

11、離子泵，使鈣離子水平增加，升高的鈣離子可激活肝細胞膜上的磷酸化酶，從而引起膜的脂質(zhì)過氧化，導致肝細胞膜的損傷5。CCl4損傷細胞膜，最終引起細胞壞死6，導致肝細胞內(nèi)的一些酶類進入血液。肝細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的含量約為血中含量的100倍，只要有l(wèi)的肝細胞壞死，就促使血清中轉(zhuǎn)氨酶活力增加1倍。由于肝細胞轉(zhuǎn)氨酶濃度比血清中高，當肝細胞膜通透性增加時，即使無壞死，細胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶也可因明顯的濃度梯度差而滲入血中，因此，血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST等)是肝細胞損傷的敏感指標，血清轉(zhuǎn)氨酶的升高在一定程度上反映了肝細胞的損傷程度7。在膽紅素(膽汁成分)的代謝過程中，肝細胞承擔著重要任務。首先是衰老紅細胞分解形成的間接膽紅

12、素隨血液循環(huán)運到肝細胞表面時，肝細胞膜微絨毛將其攝取，進入肝細胞內(nèi)，與Y、Z蛋白固定結(jié)合后送至光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，靠其中葡萄醛酸基移換酶的催化作用，使間接膽紅素與葡萄糖醛酸結(jié)合成直接膽紅素(色素I、II混合物)；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基氏體、溶酶體等參與下直接膽紅素排泄到毛細膽管中去?？梢姼渭毎哂袛z取、結(jié)合、排泄膽紅素的功能。當CCl4使肝臟細胞功能減退，受損壞死，致部分直接、間接膽紅素返流入血，導致血清中總膽紅素（TBiL）升高。故TBiL的含量可間接反映CCl4所致小鼠的肝組織細胞損傷的程度。3.2 貞草方的保肝原理 3.2.1 女貞子 本品主要含齊墩果酸、熊果酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸等。藥理研究證明

13、女貞子中齊墩果酸具有增強免疫，保肝降酶，抗動脈粥樣硬化，降血脂，降血糖等作用，女貞子提取物同時還有升高白細胞，抗衰老，耐缺氧，抗炎等作用8?，F(xiàn)有實驗證明齊墩果酸(Oleanolic acid，OA) 對CCl4引起的大鼠急性肝損傷有明顯的保護作用9 、10 ，可血清ALT含量明顯下降，肝臟脂肪變性或壞死減輕，肝內(nèi)甘油三酯蓄積減少11。根據(jù)超微結(jié)構(gòu)觀察，肝細胞內(nèi)線粒體腫脹與內(nèi)囊泡減輕，并能促進肝細胞再生。臨床應用也表明從女貞子中提取的OA治療急性黃疸性肝炎患者70例，有效率為94.3，治愈率為8012。京、滬、渝等地9所醫(yī)院觀察用齊墩果酸治療的222例慢性肝炎患者，其總有效率69.8 ，顯效率4

14、3.713。3.2.2 甘草 藥理學研究表明甘草所含甘草甜素、甘草酸、甘草甙元、黃酮、多糖等生理活性成份具有保肝，抗炎，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抗癌，抗病毒，抗菌，改善心血管系統(tǒng)，抗氧化，解毒等作用14。甘草中甘草甜素含量為6%12%，是甘草甜味的主要來源。甘草甜素具有保肝作用15。口服甘草浸膏對CCl4、甲基偶氮苯、撲熱息痛所致肝損傷有明顯的保護作用, 可減輕肝細胞變性和壞死, 降低血清轉(zhuǎn)氨酶活力, 提高肝細胞內(nèi)的糖元和DNA 含量, 促進肝細胞再生, 對肝炎病毒有抑制作用。3.2.3 女貞子和甘草聯(lián)合使用的意義和結(jié)果 某些中藥及其復方作用的特點是多成份、多途徑、多靶點，通過在整體水平上調(diào)節(jié)發(fā)揮作用，

15、體現(xiàn)了中藥復方君臣佐使整體調(diào)節(jié)、標本兼治的治病優(yōu)勢。運用中醫(yī)藥學特色理論，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學理論和方法，對已知的保肝藥物進行組方來提高防治肝病的效果，這也正是我們實驗的主要目的。3.2.3.1 女貞子和甘草聯(lián)合使用的意義 溫病大家葉天士認為：“肝為剛臟，非柔潤不能調(diào)和。”明代醫(yī)家繆希雍認為：“緩之（肝）是遂其性也，甘可以緩，甘草之屬是矣?！迸懽涌梢宰剃庰B(yǎng)肝，重用之以為君；甘能緩急，甘草一方面可以輔助女貞子柔肝緩急；另一方面甘草可以補氣益中，護住脾胃，使藥效得以更好的發(fā)揮，以之為臣。兩味藥相配伍，甘涼滋潤，保肝而不香燥，益陰而不滋膩，氣味俱薄，甘潤清靈，共奏良效。藥理實驗表明，女貞子和甘草保肝的有效

16、成分分別是齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)和甘草甜素(Glycyrrhizin，GL)，上述兩種物質(zhì)同屬三萜類化合，它們單獨應用均具有保肝作用，在二者聯(lián)合用藥時可能會有更好的療效。女貞子和甘草藥源廣、價格低廉，而且沒有明顯的副作用，如果二者配伍使用有良好的效果，將會促進保肝新藥的產(chǎn)生，具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益。3.2.3.2 女貞子和甘草聯(lián)合使用的結(jié)果 遺憾的是，本文研究未能得到預期的陽性結(jié)果。雖然模型組小鼠的肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間界限不清，肝細胞有變性，以及肝竇擴張，庫普佛細胞增生，但是ALT和AST活性僅有輕微升高，與正常組的差異不顯著，TBiL和肝指數(shù)也無明顯改變。造模的

17、不成功，使得女貞子和甘草單用或聯(lián)合應用的效果無法顯示。各用藥組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)的改變雖較模型組略輕，肝細胞的變性程度和范圍也略低，但是ALT和AST活性甚至比模型組還高。值得注意的是，甘草組和貞草方高劑量組小鼠的肝竇充血較明顯，這是否與甘草有類激素樣作用16，因引起水鈉潴留導致肝竇擴張、血容量增加有關(guān)，有待于進一步研究。3.3 特異數(shù)據(jù)的處理 記錄錯誤、儀器失靈或個別動物反應異常都會使實驗觀察值嚴重偏離總體分布。這時試驗者會發(fā)現(xiàn)，由于這種數(shù)據(jù)的存在使處理的平均值增大或縮小或者擴大了誤差方差，于是引起最終結(jié)論的改變，這種個別數(shù)據(jù)稱為特異數(shù)據(jù)（outlier）。可以根據(jù)一定的統(tǒng)計原理剔除這類特異數(shù)據(jù)。

18、當一個單獨樣本取自正態(tài)總體的假定下，如果發(fā)現(xiàn)有特異數(shù)據(jù)x0,則可令m=，m的5%及1%臨界值由特異數(shù)據(jù)剔除用表中可以查得。正常組有一只小鼠的的血清AST活性測得為446IU/L，明顯異常。計算得m=0.912，在特異數(shù)據(jù)剔除用表中，當n=6,m0.01=0.882，因此特異數(shù)據(jù)446可在1%水平上予以剔除。173.4 試驗失敗的原因分析我們第一次自主設(shè)計和操作實驗，雖有老師的指導，但受時間限制，仍準備不足，這是此次實驗造模失敗的最主要原因。3.4.1 我們經(jīng)過查閱文獻得知目前已有較為成熟的造模方法，同時考慮到開題報告會上專家們的建議，因此我們決定免去預試驗。但是文獻中大多采用的昆明種小鼠，我們

19、此次實驗出于時間上的考慮不得不采用了ICR小鼠，然而不同種系的小鼠體質(zhì)有所差異，這可能影響實驗。在實驗的過程中我們發(fā)現(xiàn)ICR小鼠較昆明種小鼠更為活躍，這給我們的灌胃操作帶來一定程度的困難。由于灌胃的損傷，實驗小鼠數(shù)目從72只逐漸減少至42只，剩下的小部分小鼠也伴有各種各樣的問題。所有的這些因素均在不同程度上影響到我們造模的成敗。3.4.2 實驗中有些小鼠因為灌胃致死，這直接導致接受造模的小鼠樣本例數(shù)太少；另一方面，由于部分小鼠取血、沉淀、離心后血清量不足，造成部分血清指標的空缺，使得最后各組小鼠血清指標樣本數(shù)量偏少，甚至出現(xiàn)一組內(nèi)只有兩個樣本，直接影響了實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗。以上因素造成實驗數(shù)據(jù)

20、檢驗不出統(tǒng)計學差異。3.4.3 我們這次使用的造模試劑是0.125%的CCl4溶液，將25l的CCl4溶于橄欖油中，定容至20ml。在這樣的配比下，溶液的油性較大、較粘稠，給腹腔注射造成了一定的難度，再加上由于CCl4的易揮發(fā)性使得CCl4的注射量可能不足，從而很大程度上導致了造模的失敗。由于造模失敗，本次試驗雖未驗證貞草方對小鼠CCl4急性肝損傷具有保護作用，但亦不能否認其保護作用。3.5 通過探索性實驗的收獲 通過實驗動物的選擇、編號、捉拿及給藥、模型制作、樣品的采集、病理組織切片等操作，我們掌握了藥理學實驗的基本知識及基本操作，培養(yǎng)了動手能力；通過對實驗結(jié)果進行科學分析、邏輯推理，最后得

21、出結(jié)論，培養(yǎng)了我們分析問題與解決問題的能力；通過實驗設(shè)計、撰寫開題報告和模擬科研論文，我們系統(tǒng)地熟悉了科學研究的基本過程和獲取知識的科學途徑。另外，由于本次試驗是由我們小組5人分工協(xié)作完成的，在整個試驗過程中，小組中每個人都能夠積極參與，這又培養(yǎng)了我們的團隊精神。通過此次實驗，我們積累了寶貴的實踐經(jīng)驗，相信我們在今后的課題研究中一定會做的更好。參考文獻1 黃兆勝中藥學M北京：人民衛(wèi)生出版社,20054672 黃兆勝中藥學M北京：人民衛(wèi)生出版社,20054264273 Plaa GLChlorinated methanol and liver injury：highlights of the p

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