非小細(xì)胞肺癌患者血清及癌組織中P185neu的定量檢測(cè)

1、非小細(xì)胞肺癌患者血清及癌組織中P185neu的定量檢測(cè)作者：李新舉，梁景仁，關(guān)正，袁育康，張智慧【摘要】 目的 探討P185neu蛋白的定量水平與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的臨床生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系。方法 采用雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)了37例NSCLC患者及17例良性肺疾病和健康對(duì)照者血清和組織中P185neu 的蛋白水平。結(jié)果 37例NSCLC患者血清和癌組織中P185neu 的蛋白水平明顯升高(P0.01)，且P185neu 蛋白水平與NSCLC細(xì)胞分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)(P0.05)。另外，NSCLC患者術(shù)前血清P185neu 的蛋白水平明顯高于術(shù)后10

2、天的血清水平(P0.01)。結(jié)論 P185neu 的蛋白水平與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；血清P185neu蛋白水平可作為評(píng)估NSCLC進(jìn)展、復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效指標(biāo)?！娟P(guān)鍵詞】 肺癌；P185neu 蛋白；雙抗體夾心ELISA法 Determination of P185neu level in serum andtumour tissue of non?small cell lung cancer ABSTRACT: Objective To investigate the relation between the level of P185neu in serum and tumo

3、ur tissue and clinical biological behaviour of non?small cell lung cancer (NSCLC). Methods By ELISA method, 37 specimens of sera and tumour tissues of non?small cell lung cancer were examined, and 17 cases of adjacent nonneoplastic tissues and sera were examined for the level of P185neu protein. Res

4、ults Of the 37 NSCLC cases, the level of P185neu in sera and tumour tissues was higher (P0.01). The level of P185neu was positively related to cell differentiation, TNM stages, and lymph node metastasis (P0.05). The preoperative serum level of P185neu was significantly higher than the postoperative

5、serum level (P0.01). Conclusion P185neu may play an important role in tumor progression and malignant potential of non?small cell lung cancer, and the level of serum P185neu could be of prognostic significance. KEY WORDS: lung cancer; P185neu ; BA?ELISA 近年來，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)研究的深入，人們?cè)噲D用分子手段進(jìn)行預(yù)防、診斷和治療肺癌。C?e

6、rbB2基因是Semba等于1985年發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物P185neu蛋白是一種具有酪氨酸激酶活性的糖蛋白，被異常激活后可導(dǎo)致細(xì)胞增殖、癌變。大量研究顯示，非小細(xì)胞肺癌(non?small cell lung cancer, NSCLC)組織中存在P185neu蛋白過度表達(dá)。但是，其在非小細(xì)胞肺癌患者血清中的含量少見報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌組織中的含量未見報(bào)道。因此，本研究采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme?linked immunosorbentassay, ELISA)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者手術(shù)前、后血清及癌組織中P185neu的含量進(jìn)行了定量檢測(cè)，以觀察P185neu在非小細(xì)

7、胞肺癌組織和血清中的含量及與肺癌臨床病理特征的關(guān)系，為臨床肺癌的診斷及治療提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 研究對(duì)象 選擇2005年8月至2006年1月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科行非小細(xì)胞肺癌手術(shù)治療、無肝炎、糖尿病以及免疫系統(tǒng)疾病等合并癥的患者37例，其中男25例，女12例，年齡45-70(平均57.78)歲；鱗癌21例，腺癌16例。病理分期(pTNM)：期與期20例，期10例，期7例。另外，選擇健康志愿者10例和肺良性病患者7例作為對(duì)照組。 1.2 試劑及方法 采用雙抗體夾心ELISA法?？筆185neu單克隆抗體(包被抗體)，P185neu標(biāo)準(zhǔn)品及辣根過氧化物酶標(biāo)記的P18

8、5neu多克隆抗體(酶標(biāo)抗體)均由四川省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科張智慧教授提供。96孔酶標(biāo)硬板購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。包被緩沖液、酶結(jié)合抗體緩沖液、勻漿介質(zhì)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、考馬斯亮蘭G?250染料均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)系提供。底物顯色液及反應(yīng)終止液由深圳晶美生物工程有限公司生產(chǎn)。抽取良性病例組及肺癌病例組術(shù)前1d、術(shù)后3d及術(shù)后10d清晨空腹靜脈血2mL，分離血清，低溫(-80)凍存待檢。另外，良性病例組及肺癌病例組均于手術(shù)當(dāng)日切取病變組織，稱重后放入液氮中凍藏，隨后制作組織勻漿，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定組織

9、勻漿中的P185neu含量。 1.3 結(jié)果判斷 根據(jù)P185neu標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度及其對(duì)應(yīng)的吸光度(A值)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，得出P185neu濃度與吸光度之間的直線方程，再根據(jù)樣本的吸光度，利用回歸方程計(jì)算出樣本中P185neu的濃度。血清樣本中P185neu濃度再乘以稀釋倍數(shù)，得出最終結(jié)果，單位為ng/mL。組織勻漿樣本中P185neu濃度再除以各組織勻漿樣本總蛋白的濃度，得出單位重量組織勻漿樣本中P185neu的濃度，單位為ng/mg protein。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。每組數(shù)據(jù)均采用s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，分組比較采用方差分析，兩

10、兩比較采用q檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 NSCLC組、良性病例及健康對(duì)照組術(shù)前血清中的P185neu含量的比較 NSCLC組、良性病例及健康對(duì)照組術(shù)前血清中P185neu含量分別為(8.951.59)ng/mL，(6.510.54)ng/mL，(6.160.56)ng/mL，單因素方差分析顯示三組之間P185neu的含量存在顯著性差異(F=20.882, P0.01)；兩兩比較分析，NSCLC組P185neu含量明顯高于良性病例組及健康對(duì)照組(P=0.001)，良性病例組與健康對(duì)照組之間無顯著性差異(P=0.217)。 2.2 NSCLC組和良性病例組癌

11、組織勻漿中P185neu含量的比較 NSCLC組和良性病例組組織勻漿中P185neu的含量分別為(16.862.79)ng/mg protein，(10.270.94)ng/mg protein，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示P185neu的含量具有顯著性差異(t=6.04，P0.01)，NSCLC組顯著高于良性病例組。 2.3 NSCLC患者術(shù)前血清及癌組織勻漿中P185neu含量與肺癌病理特征的關(guān)系 NSCLC患者術(shù)前血清中P185neu含量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、細(xì)胞分化程度及TNM分期之間有顯著性差異(P0.05)。NSCLC癌組織勻漿中P185neu含量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度及TNM

12、分期之間有顯著性差異(P0.05，表1)。 表1 NSCLC患者術(shù)前血清及癌組織勻漿中P185neu含量與肺癌病理特征的關(guān)系（略）Table 1 The relationship between P185neu level in preoperative serum and tumour tissues and pathology feature of NSCLC *P0.05,*P0.01 vs. N0 LN; P0.05 vs. T1 T2 size; P0.05 vs. degree; P0.05,P0.01 vs. stage 2.4 NSCLC和肺良性病患者術(shù)前及術(shù)后血清中P185n

13、eu含量的動(dòng)態(tài)變化 NSCLC患者術(shù)前1d、術(shù)后3d及術(shù)后10d血清中P185neu含量分別為(8.951.59)ng/mL，(9.111.95)ng/mL，(8.051.82)ng/mL，經(jīng)兩因素方差分析，術(shù)前1d及術(shù)后3d血清中P185neu的含量顯著高于術(shù)后10d的含量(F=11.34，P0.05)，術(shù)前1d與術(shù)后3d相比無顯著性差異(P=0.635)。但經(jīng)單因素方差分析，術(shù)后10d血清中P185neu含量與良性病例組及健康對(duì)照組血清中P185neu的含量之間仍存在顯著性差異(F=4.96，P=0.013，圖1)。 圖1 NSCLC患者術(shù)前、術(shù)后血清中P185neu含量的比較（略） Fi

14、g.1 Comparison of P185neu level in preoperative and postoperative serum in patient with NSCLC 2.5 NSCLC患者術(shù)前血清中P185neu含量與癌組織勻漿中P185neu含量的相關(guān)性 通過相關(guān)性分析，NSCLC患者術(shù)前血清中P185neu的含量與肺癌組織勻漿中P185neu的含量具有相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)為0.793(P0.01)，說明兩者之間呈正相關(guān)。3 討論現(xiàn)已證明，癌的發(fā)生是以多個(gè)癌基因激活和抑癌基因失活為基礎(chǔ)的多步驟多階段的過程。只有在致癌因素的刺激下，原癌基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控發(fā)生異常而激活，以致其編

15、碼蛋白表達(dá)增加，才使細(xì)胞分裂失控并最終導(dǎo)致惡變。原癌基因C?erbB2定位于人染色體17q21，編碼產(chǎn)物P185neu蛋白為具有酪氨酸激酶活性的細(xì)胞膜受體，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和分裂，在細(xì)胞增殖和分化調(diào)控中起重要作用。自從Slamon等報(bào)道C?erbB2癌基因的擴(kuò)增和(或)過度表達(dá)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系后，激起了人們對(duì)C?erbB2癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物研究的極大興趣。Brandt?Rauf等1發(fā)現(xiàn)P185neu蛋白的胞外區(qū)域可從肺腺癌細(xì)胞脫落入血, 并可在患者血清或血漿中用ELISA法檢測(cè)出來，其升高也有著和組織中P185neu過度表達(dá)相類似的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BA?ELISA法，

16、對(duì)NSCLC患者血清及腫瘤組織勻漿中P185neu含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)術(shù)前血清中P185neu含量與癌組織勻漿中P185neu含量呈高度正相關(guān)(r=0.784，P0.01)；對(duì)肺良性病變術(shù)前血清及組織勻漿和正常人血清中P185neu含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者均存在P185neu蛋白表達(dá)但無相關(guān)性(r=0.67, P=0.10)。說明P185neu在肺良性病變及正常人組織中均存在微量表達(dá)，且其表達(dá)為隨機(jī)性；而NSCLC患者血清中P185neu含量的升高是由于癌組織中P185neu蛋白表達(dá)升高引起的。因此，NSCLC患者血清中P185neu含量的檢測(cè)可間接反映癌組織中P185neu的表達(dá)狀況。NS

17、CLC患者術(shù)前1d及術(shù)后3d血清P185neu水平顯著高于術(shù)后10d的水平(P0.05)，術(shù)前1d與術(shù)后3d相比無顯著性差異(P=0.635)。上述結(jié)果表明，在行非小細(xì)胞肺癌根治性切除術(shù)切除了原發(fā)腫瘤、受侵的周圍組織以及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)后，消除了P185neu蛋白的來源，故術(shù)后血清中P185neu蛋白含量第10天明顯下降。因?yàn)槟壳吧袩oP185neu蛋白半衰期的研究報(bào)道，故推測(cè)術(shù)后3d P185neu蛋白含量與術(shù)前無顯著性差異可能與P185neu蛋白半衰期有關(guān)。癌細(xì)胞從原發(fā)灶脫落進(jìn)入血循環(huán)播散，是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)早期事件。研究表明，在淋巴結(jié)尚未轉(zhuǎn)移的期NSCLC中，約30%-50%的患

18、者已存在骨髓和血循環(huán)隱匿性癌細(xì)胞的播散2。NSCLC患者術(shù)后第10天血清中P185neu含量較術(shù)前顯著降低，但仍高于健康對(duì)照組及良性病例組，考慮其除與P185neu蛋白半衰期有關(guān)外，亦與脫落入血的癌細(xì)胞釋放P185neu蛋白有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在伴有肺門及(或)縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者術(shù)前血清中P185neu含量為(9.740.75ng/mL)，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比(7.711.79ng/mL)存在顯著性差異(P=0.004)。發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清中P185neu蛋白水平明顯高于未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者。說明P185neu蛋白過度表達(dá)與NSCLC淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。NSCLC患者臨

19、床TNM分期越晚、細(xì)胞分化越差，腫瘤體積越大，血清中P185neu含量就越高，差異有顯著性(P0.01)。說明P185neu水平越高，其肺癌進(jìn)展越快，預(yù)后越差。主要原因：細(xì)胞表面過度表達(dá)的P185neu對(duì)生長(zhǎng)因子或其他激素類因子具有超常的敏感性，從而促使細(xì)胞迅速生長(zhǎng)。而快速生長(zhǎng)的細(xì)胞失去了分化成熟的能力，逐漸發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。惡性轉(zhuǎn)變后的細(xì)胞表達(dá)出更多的P185neu，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Jeffrey 3通過分子生物學(xué)的方法證實(shí)了這一觀點(diǎn)：在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中C?erbB2基因擴(kuò)增的倍數(shù)高于原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞比原發(fā)灶癌細(xì)胞有更高的生長(zhǎng)能力。而Yu DH 4的研究也進(jìn)一步表明P185neu促進(jìn)轉(zhuǎn)移

20、及浸潤(rùn)的機(jī)理是細(xì)胞表面的P185neu定位于細(xì)胞的微絨毛及偽足，它與一種分子量為50000的蛋白結(jié)合后，使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力大大提高，從而為細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)提供了動(dòng)力。大量活化的P185neu引起體內(nèi)纖維溶酶原激活物(activator of plasminogen，AP)增加，AP激活纖維蛋白溶酶原使之轉(zhuǎn)化為纖維蛋白溶酶，后者可水解纖維粘連蛋白，使細(xì)胞間的相互粘著力下降，從而有利于腫瘤細(xì)胞的脫落和轉(zhuǎn)移。一般認(rèn)為，癌細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的過程包括癌細(xì)胞的脫落、癌細(xì)胞與基底膜的緊密附著、細(xì)胞外基質(zhì)的降解和癌細(xì)胞的移出。P185neu過表達(dá)影響某些黏附分子如上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E?cadherin)等合成，從而

21、使癌細(xì)胞彼此離散，以便于進(jìn)一步在基底膜附著；P185neu通過某種分子途徑激活了癌細(xì)胞內(nèi)基底膜分解酶，如膠原酶的活性。該酶是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，能分解上皮和血管基底膜的型膠原纖維，使基底膜產(chǎn)生局部的缺損，便于癌細(xì)胞通過并重復(fù)上述過程，從而加強(qiáng)了轉(zhuǎn)移信號(hào)或促進(jìn)了轉(zhuǎn)移信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Hirsch等5以及Selvaggi 等6報(bào)道肺腺癌原發(fā)灶為T3、T4的患者P185neu的陽(yáng)性表達(dá)率高于T1、T2的患者；、期的患者P185neu的陽(yáng)性表達(dá)率高于期的患者；細(xì)胞分化差的NSCLC的患者C?erbB2基因的表達(dá)(80.9%)明顯高于分化好者(32.4%)(P0.01)，周圍型明顯高于中央

22、型(P0.05)。推測(cè)C?erbB2基因表達(dá)與肺癌細(xì)胞分化受抑及病變進(jìn)展亦有關(guān)，P185neu表達(dá)水平越高，其細(xì)胞分化程度越低、惡性度越高。結(jié)合本研究結(jié)果，說明P185neu高表達(dá)與肺癌的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)7?8。【參考文獻(xiàn)】 1Brandt?Rauf PW, Luo JC, Carney WP, et al. Detection of increased amounts of the extracellular domain of the cerbB2 oncoprotein in serum during pulmonary carcinogenesis in human J. Int

23、 J Cancer, 2006, 56(3):383?386.2Osaki T, Mitsudomi T, Oyama T, et al. Serum level and tissue expression of c?erbB?2 protein in lung adenocarcinoma J. Chest, 1995, 108(1):157?162.3Jeffrey AK, Schwartz DA，Nordberg JE, et al. P185 expression in human lung adenocarinomas predicts shortened survival J. Cancer Res, 1990, 50(16): 5184?5191.4Yu DH, Wang SS, Dulski KM, et al. c?erbB?2/neu overexpression enhances metastatic potential of h