釀酒酵母ARS304及其側(cè)翼序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定-

1、第21期收稿日期:2011-12-16基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(61072129;內(nèi)蒙古科技大學(xué)創(chuàng)新基金(2011NCL005作者簡介:李珺(1979-,女,寧夏石嘴山人,講師,碩士,主要從事表觀遺傳學(xué)研究,(電話158*(電子信箱star1979 ;通訊作者,蔡祿,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事生物信息學(xué)與分子生物學(xué)研究工作。復(fù)制起始的調(diào)控涉及細(xì)胞周期的調(diào)控、基因擴(kuò)增、腫瘤發(fā)生等重大生物學(xué)問題,是真核生物基因表達(dá)調(diào)控的重要內(nèi)容。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae 中復(fù)制起始依賴的順式作用元件被稱為自主復(fù)制序列(Autonomously replicating sequ

2、ence ,ARS ,典型的ARS 有一段11bp 富含A /T 的保守序列5-(A /T TTTA (T /C (A /G TTT (A /T -3,稱為ACS (ARS consensus sequence ,這些位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致ARS 失去活性,進(jìn)而影響到復(fù)制起始的功能。在釀酒酵母號(hào)染色體上已發(fā)現(xiàn)有19個(gè)ARS 元件,但卻存在超過3800個(gè)與ACS 相似的序列,并且其中60%的序列能與ACS 的810個(gè)位點(diǎn)匹配1,說明自主復(fù)制并不單純受ACS 元件數(shù)目、方向以及解旋基序數(shù)目所控制,其活性可能還與其他因素有關(guān),諸如ARS 側(cè)翼序列特征、核小體定位、染色質(zhì)修飾等2。對(duì)酵母的ARS 進(jìn)行研

3、究,了解酵母染色體復(fù)制起始機(jī)制,有利于進(jìn)一步在表觀遺傳學(xué)水平上探究真核生物復(fù)制機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并鑒定釀酒酵母ARS304及其側(cè)翼序列重組質(zhì)粒,以期為以酵母為模式生物研究真核基因復(fù)制機(jī)制提供參考。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株和質(zhì)粒Esherichia coli DH5為內(nèi)蒙古科技大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室保藏。釀酒酵母YPH499(MATa ura3-52lys2-801amber ade2-101ochre trp1-63his3-200leu2-1、穿梭質(zhì)粒釀酒酵母ARS304及其側(cè)翼序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定李珺,王馨,張啟聲,蔡祿(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所,內(nèi)蒙古包頭014010

4、摘要:采用PCR 擴(kuò)增釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae 號(hào)染色體ARS304序列(S 1及以ARS304為核心上下游延伸1kb 的側(cè)翼序列(S 2,并將目的片段分別構(gòu)建到酵母整合載體pRS405中,獲得重組質(zhì)粒pRS 1和pRS 2。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pRS 2的轉(zhuǎn)化率大于pRS 1,說明ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304在釀酒酵母中自主復(fù)制的能力。關(guān)鍵詞:釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ;自主復(fù)制序列(ARS ;重組質(zhì)粒;復(fù)制起始活性中圖分類號(hào):Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):0439-8114(201221-4891-0

5、3Construction and Identification of Recombinant Plasmids ofSaccharomyces cerevisiaeARS304and Its Flank SequenceLI Jun ,WANG Xin ,ZHANG Qi-sheng ,CAI Lu(Institute of Bioengineering and Technology ,Inner Monglia University of Science and Technology ,Baotou 014010,Inner M o nglia ,China Abstract :ARS30

6、4gene (S 1and its flank sequence (S 2of Saccharomyces cerevisiae w ere cloned by PCR ,and then connect-ed into the shuttle vector pRS405.Recombinant plasmids pRS 1and pRS 2w ere successfully constructed and used for electropo-ration of S.cerevisiae .Results showed that the electricity transformation

7、 rate of pRS 2was higher than that of pRS 1,indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304in S.cerevisiae.Key words :Saccharomyces cerevisiae ;autonomously replicating sequence (ARS ;recombinant plasmids ;replication origins activity第51卷第21期2012年11月湖北農(nóng)業(yè)科

8、學(xué)H ubei A gricultural S ciencesVol.51No.21Nov .,2012湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)2012年pRS405由美國新澤西州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與分子遺傳學(xué)部Carol S.Newlon教授提供。1.1.2酶與試劑DNA Marker、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Ta K a R a公司,Agarose購自Invitrogen公司。PCR引物合成及DNA測(cè)序工作由生工生物工程(上海股份有限公司完成。1.1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L+NaCl10g/L+酵母浸提物5g/L,固體培養(yǎng)

9、基添加15g/L瓊脂,培養(yǎng)條件為37振蕩培養(yǎng)24h;酵母YPH499的培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基(胰蛋白胨20g/L+酵母浸提物10g/L,高壓滅菌20min后加入100mL滅菌的20g/L葡萄糖溶液,固體培養(yǎng)基添加15g/L瓊脂,培養(yǎng)條件為28暗培養(yǎng)18h。1.2方法1.2.1珠磨法提取釀酒酵母基因組DNA收集培養(yǎng)1618h的酵母YPH499菌液,用TE洗滌2次后溶于200L TE;加入50mg玻璃珠(直徑0.30.5 mm和100L苯酚氯仿(體積比2524,下同,渦漩振蕩23min,12000r/min離心2min;取上清,加入等體積苯酚氯仿,振蕩混勻后12000r/min 離心5min;取上清

10、,加入0.5L Rnase A,37溫浴30min;加入2倍體積的無水乙醇,-20靜置30 min;10000r/min離心5min,沉淀物用70%(體積分?jǐn)?shù),下同的乙醇洗2次,自然干燥后溶于20L TE,采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA3。1.2.2ARS304及側(cè)翼序列片段PCR擴(kuò)增及純化根據(jù)Saccharomyces Genome Database中釀酒酵母號(hào)染色體上的ARS304序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物分別擴(kuò)增釀酒酵母ARS304(S1及以ARS304為核心上下游延伸1kb的序列(S2。引物序列分別為PF1: 5-CGGGATCCCGGAAGTGCAGAACAAAGAGG-3(Ba

11、m H,PR1:5-CGCGAGCTCGGCAGGAGCAG CACACAGATC-3(Sac;PF2:5-CGGGATCCCGC TAGTGCTTAAGTTCTGTTG-3(Bam H,PR2: 5-CGCGAGCTCGGCAGTCTTTAAACGCGCCTT-3(Sac。以釀酒酵母YPH499基因組為模板,利用上述引物擴(kuò)增釀酒酵母ARS304及側(cè)翼序列。擴(kuò)增體系為50L:ddH2O37L、10×Buffer(Mg2+5L、dNTPs4L、P F(10mol/L0.5L、P R(10mol/L 0.5L、Taq DNA聚合酶1L、DNA模板2L。擴(kuò)增程序?yàn)?54.0min;9530

12、s,5135s(S2: 4845s,721min;7210min,30個(gè)循環(huán)。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,并采用純化試劑盒進(jìn)行回收純化。1.2.3重組質(zhì)粒pRS1、pRS2的構(gòu)建對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物和酵母穿梭載體pRS405進(jìn)行Bam H/ Sac雙酶切;連接pRS405酶切大片段和S1(S2雙酶切產(chǎn)物;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5;提取質(zhì)粒,對(duì)其分別進(jìn)行Pst/Sac和Sac/Hind雙酶切驗(yàn)證,驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pRS1及pRS2。1.2.4酵母電轉(zhuǎn)化具體方法參考文獻(xiàn)4,轉(zhuǎn)化效率=產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子數(shù)/質(zhì)粒DNA質(zhì)量。2結(jié)果與分析2.1釀酒酵母基因組DNA的提取結(jié)果釀酒酵母細(xì)胞壁

13、厚約25nm,以葡聚糖為主,有一定韌性。因此提取酵母基因組DNA的關(guān)鍵在于選擇一種合適的方法破壁,使菌體內(nèi)的核酸釋放出來。目前報(bào)道的酵母基因組DNA的提取方法主要有堿裂解法、液氮研磨法、超聲波法、復(fù)合酶法、珠磨法等。本實(shí)驗(yàn)采用珠磨法提取酵母基因組,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1,可以看出,提取的酵母基因組DNA條帶清晰明亮,沒有拖帶。珠磨法價(jià)格便宜,操作簡單,提取的釀酒酵母基因組滿足后續(xù)擴(kuò)增目的片段的需要。2.2S1、S2序列的PCR擴(kuò)增以釀酒酵母YPH499基因組為模板擴(kuò)增ARS304(S1,486bp和以ARS304為核心上下游延伸1kb的側(cè)翼序列(S2,2358bp,采用0.8%的瓊脂糖凝

14、膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果見圖2、圖3。從圖中可以看出,目的片段條帶單一清晰、大小與預(yù)期相符。2.3重組質(zhì)粒pRS1及pRS2克隆的鑒定將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物S1及S2經(jīng)Bam H/Sac雙酶切后分別連接到穿梭載體pRS405上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子,提取質(zhì)粒后分別用Pst/Sac和Sac/Hin d雙酶切檢測(cè)(圖4、圖5。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pRS1經(jīng)過Pst/ Sac雙酶切后出現(xiàn)大小兩條帶,短片段的大小約M.DNA Marker;1.酵母YPH499基因組DNA圖1酵母YPH499基因組 DNAM110kb1kb4892第21期(下轉(zhuǎn)第4898頁為550bp ;重組質(zhì)粒p

15、RS 2經(jīng)過Sac /Hin d 雙酶切后出現(xiàn)兩條帶,大小約為5500bp 和2400bp ,均與預(yù)期相符。2.4重組質(zhì)粒pRS 1及pRS 2功能鑒定酵母轉(zhuǎn)化效率是鑒定自主復(fù)制活性強(qiáng)弱的直接指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以整合型質(zhì)粒pRS405為陽性對(duì)照,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pRS 1及pRS 2電轉(zhuǎn)化釀酒酵母YPH499,在SD 平板上篩選Leu+的轉(zhuǎn)化子,根據(jù)酵母轉(zhuǎn)化效率判斷3種質(zhì)粒的自主復(fù)制活性,結(jié)果見圖6。圖6顯示整合型質(zhì)粒pRS405由于其復(fù)制依賴于整合到酵母的染色體上,轉(zhuǎn)化率低(6轉(zhuǎn)化子/gDNA ,而同等條件下在pRS405多克隆位點(diǎn)插入ARS304,整合型質(zhì)粒轉(zhuǎn)變成復(fù)制型質(zhì)粒pRS 1,轉(zhuǎn)化率是原

16、來的8.8倍(53轉(zhuǎn)化子/g DNA ;重組質(zhì)粒pRS 2由于包含以ARS304為核心上下游延伸1kb的側(cè)翼序列,轉(zhuǎn)化率有了顯著提高(324轉(zhuǎn)化子/gDNA ,說明ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304的自主復(fù)制活性。3小結(jié)與討論在真核細(xì)胞中,DNA 復(fù)制是在特定復(fù)制起始點(diǎn)上開始的。酵母中潛在的起始點(diǎn)比在每個(gè)細(xì)胞周期中實(shí)際使用的起始點(diǎn)要多。雖然在酵母中大多數(shù)ARS 都被復(fù)制起始識(shí)別復(fù)合體(Origin recognitioncomplex ,ORC 結(jié)合5,但其中有些位點(diǎn)的使用頻率比其他位點(diǎn)的更高,且有一些潛在的起始點(diǎn)在正常生長條件下從不使用。但是當(dāng)克隆到質(zhì)粒上時(shí),這些序列也能作為有效的起

17、始點(diǎn)行使功能6。因此,在酵母細(xì)胞核中染色體的環(huán)境能決定哪些潛在的位點(diǎn)被用作起始點(diǎn)以及使用的頻率。如酵母號(hào)染色體上有19個(gè)ARS ,但由于側(cè)翼序列的影響,并不是所有的都具有復(fù)制起始活性或活性較低7。Srienc等8研究發(fā)現(xiàn)敲除號(hào)染色體上其他高活性ARS 時(shí),ARS304的復(fù)制起始活性會(huì)大大增強(qiáng)。Eaton 等2利用高通量的序列分析測(cè)定了酵母體內(nèi)ARS 兩側(cè)的核小體定位圖譜,發(fā)現(xiàn)酵母復(fù)制起始位點(diǎn)ARS 兩側(cè)的核小體分布具有一定的規(guī)律,且ORC 的結(jié)合也需要ARS 兩側(cè)精確的核小體定位。本研究成功構(gòu)建了酵母號(hào)染色體HML 區(qū)外第一個(gè)活性較低的ARS304及以ARS304為核心上下游延伸1kb 的側(cè)翼

18、序列的重組質(zhì)粒pRS 1和350300250200150100500轉(zhuǎn)化率/轉(zhuǎn)化子/g D N ApRS405pRS 1pRS 2M.DNA Marker ;1.ARS304及側(cè)翼序列圖3ARS304側(cè)翼序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker ;1.pRS405;2.pRS 2;3.pRS 2的Sac /Hin d 雙酶切產(chǎn)物圖5重組質(zhì)粒pRS 2的酶切鑒定結(jié)果圖6pRS405、pRS 1、pRS 2 的轉(zhuǎn)化效率M 1500bp 100bpM.DNA Marker ;1.ARS304圖2ARS304PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M15kb1kbM1500bp 100bpM.DNA Marker ;1.

19、pRS 1;2.pRS 1的Pst /Sac 雙酶切產(chǎn)物圖4重組質(zhì)粒pRS 1的酶切鑒定結(jié)果M1235kb1kb李珺等:釀酒酵母ARS304及其側(cè)翼序列重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定4893湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)2012年 定性高?？梢姴捎酶牧嫉腃TAB 法提取百合鱗片總DNA 所得DNA 純度高、質(zhì)量好,適于進(jìn)行SRAP-PCR 等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。3小結(jié)與討論植物總DNA 的提取是一項(xiàng)常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。植物材料中的多糖在DNA 提取過程中會(huì)形成難溶的膠狀物與DNA 共沉淀。從多糖、多酚含量較高的植物中提取高質(zhì)量的DNA 仍具有一定難度。目前已有多種方法去除DNA 提取過程中的多糖5,多數(shù)方法針對(duì)的是糖類

20、含量少的新鮮材料,需經(jīng)過繁瑣的純化步驟。百合鱗片中含有較多的糖類、酚類等次生代謝產(chǎn)物,嚴(yán)重影響了DNA 的提取質(zhì)量。采用常規(guī)的CTAB 法提取百合總DNA ,65水浴時(shí)會(huì)氧化變褐,在加入乙醇沉淀DNA 時(shí)多糖也被沉淀,在SRAP-PCR 擴(kuò)增中譜帶極弱或無譜帶出現(xiàn),不能滿足SRAP-PCR 實(shí)驗(yàn)要求。本研究將CTAB 提取緩沖液中NaCl 濃度提高到2.5mol /L 、加入0.01mol /L -巰基乙醇,水浴過程中管內(nèi)材料無褐色出現(xiàn),說明組織的氧化程度降低;用75%的乙醇沉淀DNA 時(shí)多糖含量也降低,DNA 的質(zhì)量明顯提高。將提取的百合鱗片DNA 用于SRAP-PCR 擴(kuò)增,出現(xiàn)明顯的譜帶

21、,重復(fù)性和穩(wěn)定性較好,完全滿足擴(kuò)增的需要,可用于基于SRAP 分子標(biāo)記的百合遺傳多樣性研究。參考文獻(xiàn):1國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(一部S .北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.80.2王連英.花卉學(xué)M .北京:中國林業(yè)出版社,1988.362-364.3張克中,賈月慧,張啟翔,等.部分中國野生百合親緣關(guān)系的AFLP 技術(shù)分析J .東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,36(2:19-22.4左志銳,穆鼎,高俊平,等.百合遺傳多樣性及親緣關(guān)系的RAPD 分析J .園藝學(xué)報(bào),2005,32(3:468-472.5崔光紅,唐曉晶,黃璐琦.含淀粉及多糖類中藥材DNA 的提取方法研究J .中國中藥雜志,20

22、06,31(16:1365-1367.!1-10.百合鱗片總DNA ;M.DNA Marker圖1百合鱗片總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖譜M.DNA Marker ;1-7.樣本1的SRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物;8-15.樣本2的SRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物;16-23.樣本3的SRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物圖2SRAP-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜123M 4567891011121314151617181920212223(上接第4893頁pRS 2。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARS304側(cè)翼序列能顯著提高ARS304的復(fù)制活性。后續(xù)研究將在pRS 1、pRS 2重組質(zhì)粒上組裝核小體,研究核小體的分

23、布及定位對(duì)復(fù)制起始活性的影響。參考文獻(xiàn):1THEIS J F ,NEWLON C S.Two compound replication originsin Saccharomyces cerevisiae contain redundant origin recogni-tion complex binding sites J .Molecular and Cellular Biology ,2001,21(8:2790-2801.2EATON M L ,GALANI K ,KANG S ,et al.Conserved nucle-osome positioning defines replication origins J .Genes &De-velopment ,2010,24(8:748-753.3趙宏宇,李珺,蔡祿,等.4種酵母基因組提取方法的比較J .食品科學(xué),2011,32(9:170-173.4SAMBROOK J ,RUSSELL D W.Molec