明膠聯(lián)合VEGF內(nèi)襯血管壁防止股動脈血管成形術(shù)后狹窄的實(shí)驗(yàn)研究

1、明膠聯(lián)合VEGF內(nèi)襯血管壁防止股動脈血管成形術(shù)后狹窄的實(shí)驗(yàn)研究                     作者：蔣鷗 王志剛 喬正榮 時(shí)德【摘要】目的：評價(jià)血管重建術(shù)后內(nèi)襯明膠和內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）受損血管壁對防止血管狹窄的效果。方法：建立兔股動脈再狹窄動物模型，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)襯濃度為30%的明膠及VEGF于損傷段動脈壁，分別于2周和4周采集標(biāo)本，行圖像分析及TUNEL原位雜交，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組

2、內(nèi)膜面積（NEA）、內(nèi)中膜面積比（NEA/MA）和平滑肌細(xì)胞凋亡率，電鏡觀察平滑肌細(xì)胞的增生及凋亡情況。結(jié)果：對照組較實(shí)驗(yàn)組新生內(nèi)膜厚，而且細(xì)胞數(shù)也明顯多。對照組NEA2周及4周分別為（1.02±0.41）和（1.46±0.15）mm2比實(shí)驗(yàn)組分別為（0.57±0.15）和(1.18±0.36)mm2大。NEA/MA對照組2周及4周分別為（0.54±0.14）和(0.75±0.10)也明顯高于實(shí)驗(yàn)組分別為(0.35±0.05)和（0.62±0.25）。TUNEL陽性細(xì)胞率對照組2周為（13.6±2.4）%

3、,4周為（15.1±2.1）%，治療組分別為（18.2±5.8）%和（17.0±1.5）%。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)對照組平滑肌細(xì)胞明顯增生，細(xì)胞器發(fā)達(dá)，肌絲較多，而實(shí)驗(yàn)組見較多的凋亡小體有髓樣結(jié)構(gòu)形成。結(jié)論：提示明膠聯(lián)合VEGF內(nèi)襯血管成形術(shù)后的血管內(nèi)壁對血管再狹窄有明顯的抑制作用。    【關(guān)鍵詞】血管狹窄明膠內(nèi)皮細(xì)胞生長因子內(nèi)皮，血管兔     Investigation of vascular wall lined by Glutin and VEGF to prevent rabbit femor

4、al arteries from restenosis after angioplasty     【ABSTRACT】Objective:To evaluate the effectiveness that glutin and VEGF line the injured vasucler wall to prevent the drteries from restenosis.Methods:To build animal model of restenosis by balloon dilation in femoral artery.30 per

5、cent of glutin and VEGF were lined on injured vascular wall in the experiment,and samples were collected at 2 weeks and 4 weeks respectively.By imagine analysis system and DuTP nick end labeling,to compare neointimal area and neointimal area / media area of the control group with those of the experm

6、ent group.The hyperplasia and the apoptosis of the vascular smooth muscle cells were obsenved by electron microscopy.Results:Intima of the control was thicker thanthe experiment group,and the control group had the more number of cells than the experiment group.From the morphology,neointimal area wer

7、e reduced significantly in the experiment group(which was 0.67±0.25mm2 at the 2 weeks and 1.18±0.36 mm2 at the 4 weeks respectively)compared with the control group(which was 0.67±0.25 mm2 at the 2 weeks and 1.18±0.36 mm2 at the 4 weeks).Furthermore,NEA/MA of the experimetn group(

8、which was 0.35±0.05 at 2 weeks and 0.62±0.25 at 4 weeks)was lower than that of the control(which was 0.54±0.14 at 2 weeks and 0.75±0.10 at 4 weeks).The experiment group had the higher ratio of positive cells marked by TUNEL(which was 13.6±2.4% at 2 weeks and 15.1±2.1% a

9、t 4 weeks)than the control group(which was 18.2±5.8% at the 2 weeks and 17.0±1.5% at 4 weeks).Conclusion:It is effective to prevent artery from restenosis that glutin lines the injured vasucler wall.    【KEY WORDS】RestenosisGelatinEndothelial growth factorsEndothelium,vascul

10、arRabbits    目前各種血管成形術(shù)后再狹窄率達(dá)30%40%1，嚴(yán)重地影響手術(shù)的遠(yuǎn)期效果。目前對再狹窄的研究正轉(zhuǎn)向促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和功能恢復(fù)2。本實(shí)驗(yàn)采用明膠及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）聯(lián)合內(nèi)襯血管內(nèi)膜，觀察對促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)和功能恢復(fù)的作用，為防止和減輕血管重建術(shù)后的再狹窄提供治療依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)動物及分組  成年日本大白兔40只,體重2.53.0kg。采用完全隨機(jī)分組設(shè)計(jì)，每組10只動物。分為對照組A（2周取材

11、）、對照組B（4周取材）、實(shí)驗(yàn)組A（2周取材）和實(shí)驗(yàn)組B（4周取材）。對照組為球囊擴(kuò)張組，實(shí)驗(yàn)組為球囊擴(kuò)張+明膠內(nèi)襯組。采用10%異戊巴比妥鈉1.5ml/kg加氯氨酮5mg/kg麻醉動物。    1.2  主要試劑  VEGF10g(PeproTech EC Ltd.),TUNEL檢測試劑盒（武漢博士德公司）。    1.3  實(shí)驗(yàn)方法    1.4  標(biāo)本采集與制作  實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)2周及4周后取材。切取縫線下端約5cm動脈標(biāo)本，采用1%PPS平衡液沖洗血

12、管腔內(nèi)殘留血液，石蠟包埋，切片，HE染色，彈力纖維染色，TUNEL原位雜交，計(jì)算機(jī)圖像分析，電鏡觀察。         1.5  損傷血管細(xì)胞凋亡的計(jì)算  正常血管內(nèi)膜細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡血管內(nèi)膜細(xì)胞核呈棕黃色，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算5個(gè)高倍視野（×400）中VSMCs（血管平滑肌細(xì)胞）凋亡細(xì)胞占該視野VSMCs總數(shù)的比例，求其均值。    1.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行兩樣本均數(shù)間的t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用x±s表示，率的比較用2檢驗(yàn)。P

13、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)  果    2.1  計(jì)算機(jī)圖像分析  見表1。表1  新生內(nèi)膜面積（NEA）、新生內(nèi)膜/中膜面積比（NIA/MA）對照組2.2  TUNEL染色結(jié)果  見表2。表2  TUNEL陽性細(xì)胞率結(jié)果提示明膠聯(lián)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子內(nèi)襯血管壁促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞凋亡。    2.3  電鏡觀察  透射電鏡可見實(shí)驗(yàn)組平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)較多的空泡（凋亡早期改變）及凋亡小體，核

14、膜髓樣結(jié)構(gòu)形成（圖1A上），胞質(zhì)濃縮，核有碎裂（圖1A下）。對照組VSMC呈收縮型或增生型胞核大染色質(zhì)豐富，胞質(zhì)內(nèi)肌絲較多，線粒體高爾基體發(fā)達(dá)（圖1B）。    3  討  論    PTA、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA）、支架植入、血管移植、旁路轉(zhuǎn)流術(shù)以及血管內(nèi)膜旋切術(shù)等血管成形術(shù)是目前較有效治療動脈閉塞癥的手段，即刻成功率可達(dá)80%以上。但其中有30%50%的病人術(shù)后36月可因血管內(nèi)膜過度增生而導(dǎo)致血管再狹窄1，4

15、。如何防止血管再狹窄的發(fā)生，降低再狹窄率已成為包括心內(nèi)科、血管外科及介入學(xué)科在內(nèi)的諸多學(xué)科的研究重點(diǎn)。    目前在治療策略上主要應(yīng)用直接抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的方法，如反義癌基因和正義抑癌基因的導(dǎo)入等，但血管平滑肌細(xì)胞的增殖是血管形成再狹窄的較晚期反應(yīng)?，F(xiàn)公認(rèn)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是再狹窄的始動因素。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后局部血小板聚集并釋放各種生長因子，如血小板源性生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管緊張素等是造成動脈壁平滑肌細(xì)胞過度增生的重要因素5。血管內(nèi)皮細(xì)胞的剝脫和修復(fù)障礙在再狹窄的形成中起關(guān)鍵作用6。也有研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷面積決定新生內(nèi)膜增厚的程

16、度，內(nèi)皮細(xì)胞最后覆蓋區(qū)內(nèi)膜增生最厚，損傷后內(nèi)皮化的速度對最終形成再狹窄起關(guān)鍵作用7。    VEGF是一種糖蛋白，對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有特異性，是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性促絲裂原，可以促進(jìn)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的迅速增生，加速損傷內(nèi)膜內(nèi)皮化，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖。VEGF能有效促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞分裂和增殖，有利于損傷內(nèi)皮的迅速修復(fù)，實(shí)驗(yàn)研究和臨床實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)這點(diǎn)8，9。Asahara等7，10報(bào)道，在動物血管狹窄球囊損傷動脈模型中給予VEGF蛋白局部作用30min，2周及4周后，發(fā)現(xiàn)治療組內(nèi)皮再生情況好于對照組，內(nèi)膜厚度明顯減輕，認(rèn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)的同時(shí)抑制平滑肌細(xì)胞增殖

17、。因此如果通過保護(hù)因球囊擴(kuò)張而受損的血管內(nèi)壁和盡量加快損傷內(nèi)壁的修復(fù)，我們就可能阻斷各種因素對VSMC的刺激從而防止VSMC遷移及增殖，達(dá)到抑制內(nèi)膜過度增生的目的11。    本實(shí)驗(yàn)在既往試驗(yàn)所取得結(jié)果的基礎(chǔ)上3，進(jìn)一步證實(shí)了通過將明膠聯(lián)合VEGF內(nèi)襯于受損傷的動脈段將更有助于防止血管再狹窄，抑制平滑肌細(xì)胞增生，且較單純明膠內(nèi)襯血管壁效果佳，與文獻(xiàn)報(bào)道一致10，12。該結(jié)果為今后開發(fā)更能有效黏附于血管壁又能防止血小板在受損內(nèi)膜集聚、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的生物材料提供了依據(jù)。    參  考  文  獻(xiàn)&#

18、160;   1Forough R,Lea H,Starcher B,et al.Metalloproteinase blockade by local overexpression of TIMPlincreases elastin accumulation in rat carotid artery intimaJ.Arterioscler Thromb Vass Biol,1998,18:803807.    2Meurice T,Vallet B,Cauters C,et al.Role of endothelization cells

19、 in restenosis after coronary angioplastyJ.Fundam Clin Pharmaco,1996,10(3):234242.    3蔣鷗，王志剛，喬正榮，等.明膠內(nèi)襯血管壁防止兔股動脈血管成形術(shù)后狹窄的試驗(yàn)研究J.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2004，7（6）：347349.    4Dale WE,Batra PS,Blaaine EH,et al.Enhanced neointimal growth in cultured rabbit aorta following in vivo ballo

20、on angioplastyJ.In Vitro Cell Dev Biol Anim，1998,34(10):805812.         5Juno Deguchi,Masatoshi Makuuchi,Takashi Nakaoka,et al.Angiotensin stimulated plateletderived growth factorbchain expression in newborn rat vascular smooth muscle cells and neotintimal cells th

21、rough ras,extracelluar signalregulated protein kinase,cjun nterminal protein kinase mechanismsJ.Circ Res，1999,565574.    6Meurice T,Vallet B,Cauters C,et al.Role of endotheliazation cells in restenosis after coronary angioplastyJ.Fundam Clin Pharmacol,1996,10(3):234242.  

22、60; 7Liu MW,Roubin GS,King SB.Restenosis after coronary angioplasty potential biologic determinsnts and role initial hyperplasiaJ.Circulation,1989,79:13741384.    8Asahara T,Chen DH,Tsurumi Y,et al.Accelerated restitution of endothelial integrity and endotheliumdependent function after phVEGF165 gene transferJ.Circulation，1996,94(12):32913302.    9Laitinen M,Hartikainen J,Hiltunen MO,et al.Cathetermediated VEGF gene transfer