彗星實(shí)驗(yàn)(SCGE)和微核試驗(yàn)在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用及其進(jìn)展

1、彗星實(shí)驗(yàn)(SCGE和微核試驗(yàn)在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用及其進(jìn)展摘要:單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)又稱為彗星實(shí)驗(yàn),是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏、可靠的檢測(cè)細(xì)胞核DNA損傷的技術(shù)。目前采用的彗星實(shí)驗(yàn)有多種,可以檢測(cè)諸如DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂、堿不穩(wěn)定位點(diǎn)等多種類型的DNA損傷。堿性彗星實(shí)驗(yàn)因其高靈敏度而被廣泛采用。目前彗星實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域,近年來(lái)開始用于環(huán)境污染的基因毒性研究和生物監(jiān)測(cè),并取得了迅速發(fā)展。微核試驗(yàn)是一種以染色體斷裂及紡錘絲損傷等為測(cè)試終點(diǎn)的監(jiān)測(cè)方法,有毒物質(zhì)造成的微核形成,作用時(shí)間是細(xì)胞分裂期間的DNA和染色體復(fù)制合成過(guò)程中。因此,微核試驗(yàn)在對(duì)外來(lái)化合物(如藥品、食品添

2、加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染物等遺傳毒性檢測(cè)方面,得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)鍵詞:彗星實(shí)驗(yàn);微核試驗(yàn);多環(huán)芳烴;土壤吸附1 彗星實(shí)驗(yàn)及其進(jìn)展1.1 引言環(huán)境污染對(duì)生物遺傳物質(zhì)的影響已經(jīng)成為人們關(guān)心的環(huán)境問(wèn)題之一,一些化學(xué)物質(zhì)能夠直接或間接作用于生物體DNA,干擾或破壞DNA的復(fù)制過(guò)程,引起DNA的損傷,進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重后果。過(guò)去大量采用Allium試驗(yàn)、染色體斷裂(CA、微核試驗(yàn)(MCN等研究手段研究化學(xué)物質(zhì)對(duì)植物DNA的損傷,但是這些方法都是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的,工作量大且耗時(shí)長(zhǎng),不利于廣泛采用1。單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(single cell gel elec-trophoresis,SCGE又稱

3、為彗星試驗(yàn)(comet assay,是最近幾年發(fā)展起來(lái)的一種方法,可以在細(xì)胞水平上檢驗(yàn)真核細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù)。植物或動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞核分離后,與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合,鋪于顯微鏡載玻片上電泳后,根據(jù)DNA在瓊脂糖中的遷移來(lái)研究DNA損傷的程度。因?yàn)槠渚哂泻?jiǎn)單、快速、靈敏的特點(diǎn),而廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域2。1.2 發(fā)展SCGE是在核沉淀和光環(huán)測(cè)試等檢測(cè)方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。1978年,Rydberg等第1次直接檢測(cè)DNA損傷的程度,把單細(xì)胞包埋于凝膠中,在堿性條件下使其部分解旋,中和后以吖啶橙染色,用光度計(jì)測(cè)量紅色熒光(代表單鏈DNA和綠色熒光(代表雙鏈DNA的比例來(lái)表

4、示DNA損傷的程度。為了提高實(shí)驗(yàn)靈敏度,1984年Ostling 等3采用微電泳技術(shù),檢測(cè)射線對(duì)細(xì)胞的傷害。在他們的實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞固定于載玻片的凝膠上,用去污劑(SDS和高濃度鹽溶液使其裂解,自由DNA在中性條件下電泳,電泳結(jié)束后以熒光染料(EB染色,在熒光顯微鏡下觀察DNA的傷害程度。該方法只能檢測(cè)雙鏈DNA片段,不能檢測(cè)單鏈DNA片段4。單細(xì)胞凝膠電泳自產(chǎn)生后就處在不斷發(fā)展和完善中,以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需要。Singh等5于1988年首先提出堿性彗星實(shí)驗(yàn),用于研究X射線和過(guò)氧化氫所造成的DNA傷害,檢測(cè)的敏感性大大提高。目前我們所說(shuō)的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE就是指該方法。其后不久,Oliv

5、e等6開始了中性電泳技術(shù)和半堿性電泳技術(shù),即細(xì)胞經(jīng)堿解處理后在中性或半堿性(pH1213條件下電泳。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所采用的電泳膠板的不同,單細(xì)胞凝膠電泳可分為單層凝膠、雙層凝膠和三層凝膠電泳技術(shù)。現(xiàn)在最常用的是采用三層凝膠的堿性單細(xì)胞凝膠電泳,簡(jiǎn)單地講,就是使細(xì)三層瓊脂糖的中間層,形成類似“三明治”的結(jié)構(gòu)。1.3 實(shí)驗(yàn)原理彗星實(shí)驗(yàn)中,鑲嵌于瓊脂糖中的細(xì)胞核經(jīng)過(guò)堿性溶液處理,DNA解螺旋且變性為單鏈,在電場(chǎng)力的作用下DNA因帶負(fù)電而向陽(yáng)極移動(dòng),分子量小的DNA片斷移動(dòng)速度相對(duì)較快,而細(xì)胞核移動(dòng)相對(duì)較慢,形成類似彗星狀的圖像,因此該實(shí)驗(yàn)被稱為“彗星實(shí)驗(yàn)”。DNA受到的傷害愈嚴(yán)重,產(chǎn)生的斷鏈和堿易變性片段

6、愈多,且DNA 片斷愈小,在相同條件下DNA遷移量愈多,遷移的距離愈長(zhǎng)。因此,DNA遷移的距離(拖尾長(zhǎng)度和拖尾部分DNA 的含量(尾部熒光強(qiáng)度,可以作為細(xì)胞核損傷的表征參數(shù)。通過(guò)測(cè)定DNA遷移長(zhǎng)度或遷移部分的光密度(代表拖尾部分DNA的含量可以定量DNA的損傷程度,確定外界作用因素和DNA損傷之間的“劑量-效應(yīng)”關(guān)系78。1.4 實(shí)驗(yàn)方法目前采用的多種彗星實(shí)驗(yàn)的基本原則和實(shí)驗(yàn)操作都類似,主要包括單細(xì)胞懸浮液的獲得、電泳膠板制備、細(xì)胞裂解、DNA變性解旋、電泳、中和、染色和觀察等步驟。從理論上講SCGE技術(shù)適合于一切真核細(xì)胞,樣品細(xì)胞需要量少,細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞系或體細(xì)胞組織分離的細(xì)胞,目前已

7、經(jīng)用過(guò)的細(xì)胞有人體淋巴細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、動(dòng)物肝細(xì)胞、血細(xì)胞、植物的根細(xì)胞和葉片以及酵母細(xì)胞等2。前人的研究中根據(jù)細(xì)胞來(lái)源和種類的不同,所采用的制備方法也不完全相同,但是無(wú)論采用什么方法,都要確保在細(xì)胞分離和制備過(guò)程中不要產(chǎn)生額外的DNA傷害或修復(fù)。酶處理方法是獲得植物原生質(zhì)體或細(xì)胞核最常用方法之一,將蠶豆根尖以蒸餾水沖洗干凈后以剪刀剪碎放入小離心管,加入2%的纖維素酶和果膠酶混合液,于28處理3h9,獲得細(xì)胞核的懸浮液并用于彗星實(shí)驗(yàn).也可采用機(jī)械分離方法分離植物細(xì)胞核10:植物組織放入預(yù)冷的培養(yǎng)皿中,冰上冷凍10min,加入一定體積緩沖液,機(jī)械分離葉片細(xì)胞

8、核,以緩沖液充分沖洗葉片使細(xì)胞核游離,并傾斜培養(yǎng)皿使細(xì)胞核聚集,吸取30L細(xì)胞核的懸浮液加入一定的溴化乙錠染色后于熒光顯微鏡下觀察或進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)。膠片制備即是將獲得的細(xì)胞懸浮液與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合并鋪于載玻片,這是SCGE技術(shù)中最關(guān)鍵的步驟。三層瓊脂糖的“三明治”式結(jié)構(gòu)是目前最常用的實(shí)驗(yàn)方法,即在按照一定順序在顯微鏡載玻片上鋪三層瓊脂糖,使低熔點(diǎn)瓊脂糖和細(xì)胞核懸浮液的混合物夾在中間。有人推薦采用磨砂的載玻片,以增加低熔點(diǎn)瓊脂糖和細(xì)胞核懸浮液與載玻片間的結(jié)合力11。在三層瓊脂糖的“三明治”式結(jié)構(gòu)中,第1層為正常熔點(diǎn)的瓊脂糖(NMA層,它的作用是使第2層和第3層瓊脂糖牢固地附著于載玻片上。細(xì)胞裂解的

9、具體作用是使細(xì)胞膜、核膜和其它的生物膜受到破壞,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、RNA及其它的成分?jǐn)U散并通過(guò)凝膠進(jìn)入裂解液,只有DNA保留在原來(lái)的位置8。細(xì)胞裂解的時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有很大的影響。一般來(lái)講,裂解時(shí)間越長(zhǎng),慧尾也越長(zhǎng),但如裂解時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)因慧尾太長(zhǎng),光密度過(guò)小,而看不到慧尾。在進(jìn)行電泳前要先使細(xì)胞核中的DNA變性解旋,即將玻片浸沒(méi)于電泳液中放置一定時(shí)間。堿性彗星實(shí)驗(yàn)中采用的電泳液成分是1mmol·L-1Na2EDTA,300mmol·L-1NaOH。解旋時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞的類型和DNA損傷的程度和檢測(cè)目的。中性電泳中為了使DNA和結(jié)合的蛋白質(zhì)分開,需要1h以上的時(shí)間,堿性電泳

10、一般需要幾十分鐘的時(shí)間。解旋時(shí)間的長(zhǎng)短和中慧尾的長(zhǎng)度12。檢測(cè)的靈敏度也有一定的關(guān)系。提高解旋時(shí)間,一方面提高了檢測(cè)的靈敏度,但也增加了對(duì)照。電泳結(jié)束后,以Tris ·HCl(pH7.5中和玻片,再以無(wú)水乙醇浸埋一定時(shí)間,吸去乙醇后晾干或室溫下過(guò)夜。中和時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有很大的影響。中和時(shí)間增加,能降低觀察時(shí)背景光強(qiáng)度7。制備好的玻片以熒光染料染色后采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。一般根據(jù)自己的儀器設(shè)備和研究的需要選擇合適的熒光染料,常用的染料有溴化乙錠,吖啶橙和DAPI和YOYO21等。觀察常用的顯微鏡放大倍數(shù)一般為160400倍,要根據(jù)細(xì)胞的類型和大小選擇合適的放大倍數(shù)。利用顯微鏡

11、上的標(biāo)尺雖然可以測(cè)量DNA遷移的長(zhǎng)度,但是不能測(cè)量慧尾中DNA的含量,所以其使用上有一定的限制。近年來(lái)發(fā)展的一些圖像分析系統(tǒng)可以有效地解決這些問(wèn)題,如英國(guó)的KIAS 系統(tǒng)11。1.5 SCGE在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用近年來(lái),在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中,大量的污染物質(zhì)進(jìn)入了土壤,通過(guò)多種途徑影響環(huán)境,并最終影響人類的身體健康。早期關(guān)于土壤毒理學(xué)的研究多是通過(guò)測(cè)定土壤中污染物質(zhì)的濃度來(lái)表現(xiàn)的,但是因?yàn)橥寥辣旧斫M成的復(fù)雜性,單純用污染物質(zhì)的濃度是很難代表其潛在的毒性,只有生物毒性評(píng)價(jià)的結(jié)果可以提供復(fù)雜條件下多種污染物質(zhì)的綜合毒性13。早期土壤生態(tài)毒理學(xué)常采用植物種子發(fā)芽率、根伸長(zhǎng)和蚯蚓毒性等,這些指標(biāo)雖能綜

12、合反映土壤的污染狀況,但敏感性較低,檢測(cè)的是動(dòng)植物個(gè)體對(duì)污染物的反映,受個(gè)體差異和環(huán)境(尤其是溫度影響較大。SCGE從細(xì)胞水平闡述污染物對(duì)環(huán)境的影響,敏感性很高,已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等研究領(lǐng)域中,用于檢測(cè)物質(zhì)對(duì)DNA的損傷,但在環(huán)境監(jiān)測(cè)中,主要是用于水環(huán)境的監(jiān)測(cè),很少應(yīng)用到土壤毒理研究中,而且目前研究多是采用溶液或土壤浸提液處理動(dòng)物細(xì)胞或人體細(xì)胞。植物是生態(tài)環(huán)境的重要組成部分,近年來(lái)有研究者將植物用于SCGE,拓展了SCGE的研究對(duì)象。Gichner等10以煙草為材料研究了電離輻射和烷化劑的基因毒性,結(jié)果表明電離輻射和烷化劑都可以引起煙草DNA的雙鏈和單鏈斷裂,這些斷裂在4d后方可修復(fù)。

13、Moretti等14以人體血液外圍淋巴細(xì)胞為材料,采用姊妹染色體交換、微核試驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)研究豆田除草劑特丁凈的基因毒性。姊妹染色體交換、微核試驗(yàn)和彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,都表明與S9混合后特丁凈不引起DNA的傷害,但不與S9混合則引起細(xì)胞DNA的傷害。Ribas等15用彗星實(shí)驗(yàn)方法研究了甲草胺、莠去津、百草枯、氟樂(lè)靈等除草劑引起的DNA 傷害。研究結(jié)果表明,彗星實(shí)驗(yàn)可以有效地檢測(cè)除草劑的基因毒性,所有除草劑處理中都引起細(xì)胞拖尾的增長(zhǎng);這些除草劑都具有基因毒性,代謝過(guò)程影響除草劑本身的基因毒性。1996年Koppen第一次報(bào)道了利用植物為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行彗星實(shí)驗(yàn)16。植物毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)是進(jìn)行環(huán)境污染原位監(jiān)測(cè)

14、的最好方法之一10,利用植物彗星實(shí)驗(yàn)可以進(jìn)行環(huán)境致突變物的檢測(cè),而且植物彗星實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物細(xì)胞彗星實(shí)驗(yàn)一樣可靠,所以有必要進(jìn)一步拓展植物彗星實(shí)驗(yàn)的研究,建立環(huán)境污染引起植物DNA損傷的監(jiān)測(cè)系統(tǒng),及時(shí)有效地進(jìn)行環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。近年來(lái)植物彗星實(shí)驗(yàn)有了較大發(fā)展1217,但并非所有植物都可以應(yīng)用于彗星實(shí)驗(yàn)。2005年林愛(ài)軍等19應(yīng)用彗星實(shí)驗(yàn)研究了鎘對(duì)小麥葉片DNA的傷害。2006年林愛(ài)軍等18利用不同植物進(jìn)行DNA損傷彗星實(shí)驗(yàn),結(jié)果得出蠶豆、菠菜、洋蔥、菜豆、大蒜等植物的根尖和葉片都可以應(yīng)用于植物彗星實(shí)驗(yàn),但利用水稻組織進(jìn)行彗星試實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有獲得明顯的彗星圖像。1.6 SCGE的展望和發(fā)展趨勢(shì)單細(xì)胞凝膠電

15、泳是一種可以檢測(cè)細(xì)胞水平上基因傷害程度的手段,具有敏感、簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)取得了廣泛的應(yīng)用。因細(xì)胞的種類不同、所處的階段不同,其敏感性和修復(fù)能力不同,在操作中要考慮多種因素的影響,以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可比性。今后對(duì)“彗星”的形成機(jī)制需要進(jìn)一步研究。2微核試驗(yàn)及其研究進(jìn)展2 微核試驗(yàn)及其進(jìn)展2.1 微核試驗(yàn)微核是指位于細(xì)胞漿中獨(dú)立于主核的核小體,主要由外界損害因素(生物的、物理的、化學(xué)的作用細(xì)胞后,導(dǎo)致細(xì)胞染色體丟失或斷裂,從而在胞漿中形成1個(gè)或數(shù)個(gè)小核20。微核試驗(yàn)是一種以染色體斷裂及紡錘絲損傷等為測(cè)試終點(diǎn)的監(jiān)測(cè)方法,有毒物質(zhì)造成的微核形成,作用時(shí)間是細(xì)胞分裂期間的DNA和染色體復(fù)制合成過(guò)程中

16、。因此,微核試驗(yàn)在對(duì)外來(lái)化合物(如藥品、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品、環(huán)境污染物等遺傳毒性檢測(cè)方面,得到了廣泛應(yīng)用。同時(shí),該方法在職業(yè)暴露人群遺傳損害監(jiān)測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)生態(tài)環(huán)境檢測(cè)方面,也得到了大量的應(yīng)用。微核試驗(yàn)最大的優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速,而國(guó)內(nèi)外大量的對(duì)比試驗(yàn)研究,比較一致的看法是該方法在敏感性、特異性和準(zhǔn)確性方面,與經(jīng)典的染色體畸變分析方法基本相當(dāng)21。因而,特別適合作為大量化合物和現(xiàn)場(chǎng)人群初篩的實(shí)驗(yàn)方法。微核試驗(yàn)創(chuàng)建于20世紀(jì)70年代中期(197319752223目前許多國(guó)家和國(guó)際組織,已將其規(guī)定為新藥、食品添加劑、農(nóng)藥、化妝品等毒理安全性評(píng)價(jià)的必做試驗(yàn)。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和滲

17、透到微核研究中,大大拓展了微核試驗(yàn)的檢測(cè)和應(yīng)用范圍,已發(fā)展成為能同時(shí)檢測(cè)染色體斷裂、丟失、分裂延遲、不分離、DNA損傷修復(fù)障礙、Hprt基因突變、凋亡、細(xì)胞分裂不平衡等多種遺傳損害終點(diǎn),因而近年來(lái)國(guó)際上有人提出了新微核試驗(yàn)(new micro nu-cleus test概念24,從而使微核試驗(yàn)煥發(fā)出新的生機(jī)。2.2 植物微核試驗(yàn)微核試驗(yàn)不要求中期相細(xì)胞,幾乎所有的細(xì)胞都能觀察到微核25,所用的材料可以是植物或動(dòng)物組織和細(xì)胞。植物微核測(cè)定常用根尖和四分體。動(dòng)物微核測(cè)定技術(shù)常采用大、小鼠骨髓細(xì)胞和人的外周血淋巴細(xì)胞。隨著微核形成機(jī)理和意義的闡明以及檢測(cè)手段和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善,微核試驗(yàn)特別植

18、物微核試驗(yàn),在水體(三致性監(jiān)測(cè)得到廣泛應(yīng)用,植物微核試驗(yàn)在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用則較少,有待進(jìn)一步研究與發(fā)展。在目前應(yīng)用最多的植物微核試驗(yàn)是紫露草微核技術(shù)(Tradescant ia paludosa MCN Test(也稱紫露草四分體微核監(jiān)測(cè)法和蠶豆根尖細(xì)胞微核技術(shù)(Viciafaba MCN Test。蠶豆(Vicia faba根尖細(xì)胞的染色體數(shù)目少(2n=12,染色體大,DNA含量多,有長(zhǎng)的中間著絲粒染色體一對(duì),其它5對(duì)是較短的近端著絲粒染色體,便于觀察,對(duì)誘變物反應(yīng)敏感,可常年使用,適用于水質(zhì)致突變性污染的常規(guī)監(jiān)測(cè),蠶豆根尖微核試驗(yàn)不僅能發(fā)現(xiàn)有機(jī)化學(xué)物的致突變性,而且也能了現(xiàn)有機(jī)化學(xué)物

19、的植物化謝產(chǎn)物的致突變性,其代謝產(chǎn)物類似于完整動(dòng)物的代謝產(chǎn)物。因此,蠶豆根尖微核試驗(yàn)被列入國(guó)家環(huán)保局編制的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范(水環(huán)境部分受到廣泛應(yīng)用?？字久鞯妊芯勘砻鞅槐O(jiān)測(cè)毒物或污染物不能嚴(yán)重阻礙細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂,否則不能正確反映被檢測(cè)目標(biāo)。紫露草(Tradescantiap aludosa品種本底微核率低;植株體較小,容易進(jìn)行繁殖,載培適宜溫度25左右,在我國(guó)大部分地區(qū)可在溫室保種越冬載培,具有常年獲取材料的優(yōu)點(diǎn)。紫露草花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂,有高度的同步現(xiàn)象,各分裂期的敏感性又有不同,利用這兩個(gè)特性,我們可以在高度敏感的分裂期中,誘導(dǎo)產(chǎn)生最大量的染色體的損傷,并且在同步的四分體中得到大量的微核,

20、因此其特別適合于微核試驗(yàn)26,紫露草微核試驗(yàn)除具有一般微核試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)外,其優(yōu)勢(shì)是可以現(xiàn)場(chǎng)測(cè)受污染的水樣27。紫露草微核試驗(yàn)是由美國(guó)馬德修教授開創(chuàng)的,已廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測(cè)28。2.3 植物微核試驗(yàn)應(yīng)用于土壤生態(tài)毒理學(xué)中的測(cè)試方法應(yīng)用植物微核試驗(yàn)測(cè)試土壤中污染物毒性一般采用浸提法和盆栽法。宋玉芳、周啟星等29在用土壤溶液浸提法進(jìn)行蠶豆根尖微核試驗(yàn)中采用以下方法。浸泡蠶豆種子2630h, 25恒溫培養(yǎng)1224h,將種子取出在25再培養(yǎng)3648h。種子初生根長(zhǎng)23cm可做樣品監(jiān)測(cè)。稱取過(guò)5mm篩土壤50g于500mL三角瓶中,加蒸餾水250mL(水土比5:1,充分振蕩混均后靜止24h。取上清夜進(jìn)行染毒

21、試驗(yàn)。將終止染毒的幼苗置于燒杯中用蒸餾水沖洗并修復(fù)20h。25培養(yǎng)24h。切蠶豆根尖1cm,用諾卡氏液固定24h。固定根用水洗2次,再用1mol/L HCl在60水浴浸泡8min使根尖軟化。在暗處用Shiff試劑對(duì)上述軟化的根尖在30染色24h。染色后將根尖用偏亞硫酸鈉洗滌2次。將染毒處理根尖保存在4蒸餾水中待制片用。切去根尖頂部1mm,取根尖2mm,放置在玻片上,滴加45%醋酸1滴,用橡皮頭輕輕的將根尖均勻壓碎,在顯微鏡下觀察,用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),并查出微核數(shù),以1000個(gè)細(xì)胞中出現(xiàn)的微核數(shù)表示微核千分率( MCN×103:PI=樣品實(shí)測(cè)微核數(shù)(1/1000平均值÷對(duì)照中的微核

22、數(shù)將蠶豆種子按本室建立的常規(guī)方法浸種催芽,等初生根長(zhǎng)至2 3cm時(shí),將發(fā)芽的種子種人盛有不同土樣的花缽中,待幼苗長(zhǎng)出2 4片真葉時(shí),將整株幼苗從土樣中取出,用自來(lái)水沖洗干凈,以終止染毒。再將幼苗置燒杯中,用自來(lái)水沒(méi)住根部,修復(fù)20h。整株幼苗用Carnoys液固定。每一處理選5株固定好的幼苗,按本室建立的常規(guī)程序分別制作根尖、葉尖細(xì)胞壓片以。每片觀察計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)微核千分率(MCN30。2.4 植物微核試驗(yàn)在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用及其進(jìn)展1978年馬德修先生以美國(guó)產(chǎn)紫露草(Tradeseantia paludosa為材料,通過(guò)花粉母細(xì)胞四分體微核數(shù)量作為測(cè)定環(huán)境污染技術(shù),取得了良好效

23、果。1979年山東海洋學(xué)院與中科院海洋研究所和Te一HsiuMa教授三方合作,成立了中美合作研究用植物細(xì)胞MCN監(jiān)測(cè)污染研究組,并取得初步結(jié)果。1980年Degrassi和Rizzoni建立了蠶豆次生根尖微核監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。1982年Degrassi提出利用微核千分率技術(shù)作為誘變劑的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。此后越來(lái)越多的人采用各種植物微核技術(shù)進(jìn)行不同領(lǐng)域的監(jiān)測(cè)研究。利用植物微核監(jiān)測(cè)技術(shù)監(jiān)測(cè)水質(zhì)污染、大氣污染和土壤污染,是一種行之有效的方法。1991年金波、陳光榮等30利用蠶豆葉尖和根尖細(xì)胞微核技術(shù),監(jiān)測(cè)湖北省洪湖、應(yīng)城兩市近郊農(nóng)業(yè)土壤污染的情況,獲得明顯效果。宋玉芳,周啟星等進(jìn)行土壤整體質(zhì)量的生態(tài)毒性評(píng)價(jià),其中生

24、態(tài)毒性試驗(yàn)之一用土壤溶液浸提法進(jìn)行蠶豆根尖微核試驗(yàn)參考文獻(xiàn)1 Navarrete M H,Carrera P,Miguel M,et al.A fast comet assay variant for solid tissue cells.The assessment of DNA damage in higher plants J .Mutation Research,1997,389 :271-2772 林愛(ài)軍、耿春女、朱永官等.單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)及在土壤生態(tài)毒理學(xué)中的應(yīng)用 J .生態(tài)學(xué)雜志,2005,24(8:975-9795 Singh NP,McCoy MT,Tice RR,et a

25、l.A simple technique for quantization of low levels of DNA damage in individual cells J .Exp.Cell Res,1988, 175 (1:184-1916 Olive PL,Banath J P,Durand RE.Heterogeneity in radiation induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the“comet”assay J.Radiat.Res,1990,122 (1:86-94.7

26、 孟紫強(qiáng),張連珍.單細(xì)胞微凝膠電泳技術(shù)在人血淋巴細(xì)胞DNA損傷研究中的應(yīng)用J.遺傳學(xué)報(bào),1998,25 (4:294-3008 孟紫強(qiáng),張連珍.應(yīng)用單細(xì)胞微凝膠電泳技術(shù)研究細(xì)胞DNA損傷的原理與方法J.癌變·畸變·突變,1998,10 (6:377-3829 Ning S B,Song Y C,Patrick van Damme.Characterization of the early stages of programmed cell death in maize root cells by using comet assay and the combination o

27、f cell electrophoresis with an nexin binding J .Electrophoresis ,2002,23:2096-210210 Gichner T,Ptacek O,Stavreva D A,et al.A comparison of DNA repair using the comet assay in tobacco seedlings after exposure to alkylating agents or ionizing radiation J.Mutation Research,2000,470:1-911 姜樹林,青雪梅,孫殿軍.用S

28、CGE法觀察砷、氟、黃綠青霉素和T22毒素引起的SCG29071細(xì)胞基因組DNA 損傷J.中國(guó)地方病學(xué)雜志,2003,22 (4: 289-29112 Yendle J E ,Tinwell H ,Elliott BM,et al.The genetic toxicity of time:Importance of DNA unwinding time to the outcome of single cell gel electrophoresisassays J.Mutat.Res,1997,375:125-13613 Watanabe T,Hirayama T.Genotoxicity

29、of soil J.J.Health Sci,2001,47 (5:433-43814 Moretti M,Marcarelli M,Villarini M,et al.In vitro testing for genotoxicity of the herbicide terbutryn:Cytogenetic and primary DNA damage J.Toxi.Vitro, 2002,16:81-8815 Ribasa G,Frenzillib G,Baraleb R,et al.Herbicide induced DNA damage in human lymphocytes e

30、valuated by the single cellgel elect rophoresis (SCGE assay J.Mutat.Res,1995,344 (1:41-5416 Koppen G,Verschaeve L.The alkaline comet test on plant cells:A new genotoxicity test for DNA strand breaks in Vicia faba root cell J .Mutation Research, 1996,360:193-20017 Gichner T,Stavreva D A,Breusegem F V

31、.o- Phenylenediamine-induced DNA damage and mutagenicity in tobacco seedlings is light-dependent J.Mutation Research,2001,495:117-12518 林愛(ài)軍、張旭紅、張?jiān)隼?利用不同植物進(jìn)行DNA損傷彗星實(shí)驗(yàn)的方法比較J.生態(tài)毒理學(xué)報(bào),2006,1(2:165-17119 林愛(ài)軍,張旭紅,朱永官.鎘對(duì)小麥葉片DNA傷害的彗星實(shí)驗(yàn)研究J.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2005,25(3:329-33320 曹佳,林真,余爭(zhēng)平主編:微核試驗(yàn)原理、方法及其在人群監(jiān)測(cè)和毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用M .北京:

32、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,2000,1-921 Heddle J A,Cimino M C,Hayashi M,et al.Micronuclei as an index of cytogenetic damage:Past ,Present and Future J.Environ Mole Mutagen,1991, 18:277-29122 Heddle J A.A rapid in vivo test for chromosomal damageJ.Mut at Res,1973,18:187-19023 Schmid W.T he micronucleus test J.Mut at Re

33、s,1975,31:9-1524 Fenech M.The advantanges and disadvantanges of the cytokinesis-block micronucleus method J.Mutat Res,1997,392(1-2:11-18.25 邢衛(wèi)平,趙恒奎,姜宗榮.微核及微核試驗(yàn)在遺傳毒理學(xué)中的應(yīng)用J.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(5:317-32026 胡斌段,昌群,李琴等.昆明盤龍江水質(zhì)的突變性研究J.重慶環(huán)境科學(xué),1997,19(6:14-1827 邢衛(wèi)平,趙恒奎,姜宗榮.微核及微核試驗(yàn)在遺傳毒理學(xué)中的應(yīng)用J.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2002,8( 5:

34、317-32028 蔡亞娜,繆紳裕,鄭燕玲.我國(guó)紫露草生物分析方法的研究與應(yīng)用概況J.癌變 畸變 突變,1998,10( 2 :12829 宋玉芳,周啟星,宋雪英等土壤整體質(zhì)量的生態(tài)毒性評(píng)價(jià)J .環(huán)境科學(xué),2005,26:130-13430 金波、陳光榮、李明等蠶豆(Vicia faba細(xì)胞微核技術(shù)監(jiān)測(cè)農(nóng)業(yè)土壤污染的研究J.環(huán)境科學(xué),1991,13(3:74-7731 Tao S,Xu F L,Liu W X,Cui Y H,Coveney R M J R.A chemical extraction method for mimicking bioavailability of polycyc

35、lic aromatic hydrocarbons to wheat grown in soils containing various amounts of organic matter.Environmental Science and Technology,2006,40:2219-222432 Su Y H,Zhu Y G.Uptake of selected PAHs from contaminated soils by rice seedlings (Oryza sativa and influence of rhizosphere on PAHdistribution.Envir

36、onmental Pollution,2008,155:359-36533 Zhu Y H,Zhang S Z,Huang H L,Wen B.Effects of maize root exudates and organic acids on the desorption of phenanthrene from soils.Journal of Environmental Sciences,2009,21:920-92634 Kang F X,Gao Y Z,Q Wang.Inhibition of free DNA degradation by the deformation of DNA exposed to trace polycyclic aromatic hydrocarbon contaminants.Environmental Science and Technology,2010,44:8891-889635 安瓊,陳祖義.氟樂(lè)靈在土壤中的結(jié)合殘留以及對(duì)作物的影響J.環(huán)境