乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)試劑

1、雌激素受體(ER)核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒說明書(PCR-熒光探針法)【名稱】通 用 名：人雌激素受體基因(ER)核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒英 文 名：Human Estrogen Receptor Fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction (PCR)Diagnostic kit 漢語拼音：ren ci ji su shou ti ji yin he suan kuo zeng jian ce shi ji he shuo ming shu【目的】本試劑盒適用于檢測(cè)乳腺癌、前列腺癌等患者組織及全血等樣本中雌激素受體(ER)基因的表達(dá)，用于臨床輔助

2、診斷及其病人藥物治療的療效監(jiān)控。其檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考。【原理】本試劑盒選取一對(duì)人雌激素受體(ER)基因特異性引物和一條特異性熒光雜交探針，應(yīng)用Trizol提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，后者在耐熱DNA聚合酶(Taq酶)作用下，配以FQ-Buffer(內(nèi)含Mg2+、Tris-HCl等)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過PCR-熒光探針體外擴(kuò)增法對(duì)雌激素受體(ER)基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而達(dá)到快速準(zhǔn)確實(shí)時(shí)定量檢測(cè)之目的。【組成】名 稱數(shù) 量規(guī) 格RNA提取液B1 管500l/管 逆轉(zhuǎn)錄酶系1 管40l/管 ER-RT MIX2 管140l/管 Taq 酶系1 管80l/管

3、ER-PCR MIX1 管960l/管ER陽性質(zhì)控品1 管50l/管(1107Copies/ml)陰性質(zhì)控品 1 管500l/管DEPC 水1 管2000l/管備注： 10RCLB、RNA 提取液A (500l Trizol reagents)等另行配備?！緲?biāo)本采集、保存和運(yùn)輸】1. 適用標(biāo)本類型：新鮮全血或組織等標(biāo)本。2. 標(biāo)本采集：新鮮全血：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2-5毫升，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的5ml玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合510次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻。密閉送檢。新鮮組織：無菌條件下取受檢者腫瘤組織1g左右，轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml的離

4、心管中，密閉送檢。3. 保存和運(yùn)輸：標(biāo)本應(yīng)立即用于測(cè)試，也可保存于-80或液氮待測(cè)，標(biāo)本運(yùn)送時(shí)應(yīng)采用0冰壺?！具m用儀器】主要包括ABI GeneAmp PCR System7700、ABI GeneAmp PCR System7500、ABI PRISM 7300、LightCycler等毛細(xì)管的儀器，MJ Opticon系列或取得資格認(rèn)證的定量PCR儀?！举A藏、規(guī)格及有效期】40份/盒。-20避光保存，避免反復(fù)凍融。有效期12個(gè)月?！臼褂梅椒ā?RNA提取 1.1標(biāo)本處理全血：淋巴細(xì)胞分離 (用戶亦可用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞)：將抗凝血搖勻，取500l轉(zhuǎn)至一潔凈的1.5ml 離心管中，編

5、號(hào)標(biāo)記。加入1ml 1RCLB-紅細(xì)胞裂解液(RCLB,試劑盒配備10RCLB，使用前請(qǐng)用雙蒸餾水按1：9比例配制成1RCLB)，劇烈震蕩30s，3000g離心5min，棄上清。重復(fù)裂解兩至三次至無明顯紅色沉淀。加入1ml生理鹽水，劇烈震蕩15s，13,000g離心1min，棄上清。沉淀加入500l RNA 提取液A (Trizol reagents)，反復(fù)吹打，室溫放置5min。新鮮組織：取新鮮腫瘤組織50mg左右，液氮研磨，加500l RNA 提取液A (500l Trizol reagents)，充分混勻，室溫放置5min。1.2. 加入100l氯仿，用力震蕩15s，室溫靜置2min，4

6、 13,000rpm離心5min。1.3. 小心將上層水相轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加300l無水乙醇，然后加10l RNA 提取液B（使用前請(qǐng)室溫溶解并充分混勻），充分混勻，13,000rpm離心1min。1.4. 棄上清，加入500 l 75%的DEPC乙醇，充分混勻，13,000rpm離心1min，小心吸去大部分乙醇。1.5. 將提取管敞口在室溫空氣中干燥5min待乙醇揮發(fā)干凈，用20l DEPC H2O溶解沉淀。陰性質(zhì)控品：取100l陰性質(zhì)控品加入500 l RNA提取液A(Trizol reagents)充分震蕩，室溫放置5min。后按1.21.5操作。ER陽性質(zhì)控品：直接取4l進(jìn)行PCR

7、擴(kuò)增。或按照PCR擴(kuò)增介紹方法進(jìn)行定量分析。2. 逆轉(zhuǎn)錄 根據(jù)標(biāo)本數(shù)量取DEPC水處理的200l PCR反應(yīng)管，取出ERRT MIX、逆轉(zhuǎn)錄酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。向反應(yīng)管中加1l逆轉(zhuǎn)錄酶系，7l ER-RT-MIX，充分混勻后短暫離心，4230分鐘，后98 5min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。即得到cDNA。3PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出ER PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10,000rpm離心10s。設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+4管陽性對(duì)照），每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：試劑ER PCR MIXTaq酶系用量24l2l計(jì)算好

8、各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10,000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入26l，向每管中加入處理后樣品(所獲得的cDNA樣品)或ER陽性質(zhì)控品(使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1000倍，記為110P6PCopies/ml，110P5PCopies/ml，110P4PCopies/ml)和陰性質(zhì)控品4l，10,000rpm瞬時(shí)離心30秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性控品，陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體積(30l)、樣品名稱、標(biāo)記熒光基團(tuán)種類(報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA)和循環(huán)條件：AB

9、I PRISM 7700，ABI PRISM5700，ABI GeneAmp 7000 (需要剪掉反應(yīng)蓋)，ABI PRISM7300/7500(使用8聯(lián)管)，MJ Opticon(使用8聯(lián)管)等使用薄壁管的儀器，循環(huán)條件：942分鐘，后93 30秒55 45秒， 40個(gè)循環(huán)。LightCycler等使用毛細(xì)管的儀器，循環(huán)條件：942分鐘，后93 5秒56 45秒，共40個(gè)循環(huán)。3結(jié)果分析判定反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)baseline的start值（38），stop值（1318）以及Threshold值，使Std curve 窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線達(dá)到最佳（correlation

10、數(shù)值介于-0.97-1之間，correlation數(shù)值等同于r值），最后到Reporter窗口下記錄儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值（Qty-Copies/ml）?！举|(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)】陰性質(zhì)控品：全部陰性。沒有熒光值增長(zhǎng)。ER陽性質(zhì)控品：陽性質(zhì)控品的 Ct 值均應(yīng)小于 35.0。r0.97（correlation數(shù)值介于-0.97-1之間，correlation數(shù)值等同于r值）。 以上條件應(yīng)同時(shí)滿足 ，否則，此次試驗(yàn)視為無效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行?！窘Y(jié)果判定】測(cè)定結(jié)果的計(jì)算：如果Ct值38，則實(shí)驗(yàn)樣品的ER含量(基因拷貝數(shù)/ml)= Qty-Copies/ml。如果38Ct值40,為灰區(qū)建議重新檢測(cè)，重新檢測(cè)若38Ct值40判為陽性，否則為陰性。如果Ct值=40，則ER含量（基因拷貝數(shù)/ml）110P2PCopies/ml (低于檢測(cè)下限)?！咀⒁馐马?xiàng)】 使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。并且嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)充分融化混勻并經(jīng)高速短暫離心后試用。試劑盒須避光保存，以免熒光物質(zhì)衰減。所有使用的離心管、 Tip 頭應(yīng)DEPC水處理并高壓滅菌，而且必須不含RNase。樣本提取、試劑配置、加樣需在不同區(qū)的超凈工作臺(tái)進(jìn)行，以免污染。試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照衛(wèi)生部微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通則進(jìn)行處理?！旧a(chǎn)企業(yè)】公司名稱：北京索奧生物醫(yī)藥