響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)菌纖維素發(fā)酵合成工藝

1、響應(yīng)面法優(yōu)化細(xì)菌纖維素發(fā)酵合成工藝                   作者：袁帥，胡承，曹海鵬，唐德芳，孫苗苗  【摘要】   目的對(duì)細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌株葡糖醋桿菌G-29進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，以提高其細(xì)菌纖維素合成能力。方法采用基于非完全平衡塊原理的Plackett-Burman(PB) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，篩選出了3個(gè)主要影響因子：混合碳源（葡萄糖蔗糖=12），MgSO4，乙醇，然后采用Box-Be

2、hnten中心，組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析方法（RSM）確定其最佳濃度分別為混合碳原52.3g/L，MgSO40.159 8 g/L，乙醇32.5 ml/L。用掃描電鏡觀察了細(xì)菌纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并通過X射線衍射分析其在干態(tài)下和濕態(tài)下的最佳結(jié)構(gòu)。結(jié)果在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，菌株G-29發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為11.83 g/L，是優(yōu)化前產(chǎn)量（6.20 g/L）的1.9倍。結(jié)論P(yáng)B試驗(yàn)和RSM相結(jié)合的試驗(yàn)方法，用于優(yōu)化G-29發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅 科學(xué) 合理而且準(zhǔn)確有效。 【關(guān)鍵詞】   葡糖醋桿菌屬 細(xì)菌纖維素 Plackett-Burman設(shè)計(jì) 響應(yīng)面分析Abstract：Objectiv

3、Ein this manuscript,the optimal conditions for cellulose production by gluconacetoba-ater G-29 were determined in order to improve the yield of bacterial cellulose.MethodsPlackett-Burman Design was used to evaluate three statistically significant parameters including mixed carbon sources(Glucose:suc

4、rose=1:2),MgSO4,ethanol.The optimal levels of three variables were defined by Box-Behnken design and response surface method(RSM):mixed carbon sources:52.3 g/L,MgSO4 0.159 g/L,ethanol 32.5 g/L,ethanol 32.5 g/L comparison.The morphology of bacterial cellulose(BC) produced was observed by scanning ele

5、ctron microscope(SEM).The crystal structure of BC in dried and wet state was studied by X-ray diffractometry(XRD).ResultsThe results indicated that the BC yield under the optimal fermentation medium was 11.83 g/L,which was as 1.9 times as that under the original fermentation medium.ConclusionThe met

6、hod of PB design combined with RSM used for optimization of G-29 fermentation medium is scientific and accurate.Key words： Gluconacetobacter;   Bacterial cellulose;   Plackett-Burman design;   Response surface method    細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose，簡(jiǎn)稱 BC)是由部

7、分細(xì)菌產(chǎn)生的一類高分子化合物，在化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)上同植物纖維相同，都是由D-葡萄糖以-1,4糖苷鍵連接形成直鏈多糖，再經(jīng)聚合而成。與植物纖維不同的是細(xì)菌纖維素是以單一纖維形式存在，純度極高，不摻雜如植物纖維中的半纖維素或木質(zhì)素等其它多糖類1，因此其具有抗拉強(qiáng)度高、 楊氏模量高、良好的生物適應(yīng)性以及優(yōu)良的持水性和通透性等特點(diǎn)2。除了可用作膳食纖維和食品成型劑，還可用于生產(chǎn)紗布、繃帶、人造皮膚等生物醫(yī)學(xué)用品，有利于皮膚組織生長(zhǎng)和限制感染。    自1987年以來，已有很多關(guān)于細(xì)菌纖維素膜用于燒傷、燙傷、皮膚移植等 治療 的報(bào)道，目前已 發(fā)展 出紗布、繃帶和“創(chuàng)可貼”等各

8、種傷科敷料商品。它具有在傷口中維持濕的環(huán)境，防止體液流出，保持高機(jī)械強(qiáng)度，對(duì)液、氣具有良好通透性，與皮膚相容性好、無毒、不發(fā)熱，良好的防菌和隔離性等眾多特點(diǎn)，均優(yōu)于當(dāng)今其它人造皮膚和傷科敷料。早在20世紀(jì)80年代初，巴西的Biofill公司就開始了用細(xì)菌纖維素膜制造傷科敷料的研究，成功開發(fā)出人造動(dòng)脈，人造血管與人造皮膚等醫(yī)療用品3，并已成功地應(yīng)用于處理皮膚移植和慢性皮膚潰瘍。這種材料可有效緩解疼痛，防止細(xì)菌感染，有利于皮膚組織生長(zhǎng)，促進(jìn)傷口愈合，對(duì)水分及電解物有良好的通透性，與傳統(tǒng)的材料相比，這種材料成本低，處理時(shí)間短，更有利于健康皮膚的生長(zhǎng)4。除此之外，細(xì)菌纖維素還可作為緩釋藥物的載體，軟骨

9、組織工程的支架材料5等。    能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的細(xì)菌種類較多，常見的有醋酸菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、根瘤菌屬和八疊球菌屬等9個(gè)屬中的某些種。其中醋酸菌屬中的木醋桿菌（Acetobacter xylinum）是最早被發(fā)現(xiàn)同時(shí)也是研究較為透徹的纖維素產(chǎn)生菌，現(xiàn)已作為研究纖維素生物合成過程和機(jī)制的模式菌株。根據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)第9版，木醋桿菌已被劃分到葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）中，改為木葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter xylinum）。    近

10、幾年關(guān)于細(xì)菌纖維素生產(chǎn)合成的研究仍多以木葡糖醋桿菌或其變種做為試驗(yàn)菌種，為此，本實(shí)驗(yàn)室分離篩選出一株細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌G-29，并經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定該菌為葡糖醋桿菌屬中一個(gè)新的菌種。    本實(shí)驗(yàn)以G-29為試驗(yàn)菌種，在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法6，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基的諸多營養(yǎng)因素進(jìn)行考察和評(píng)價(jià)，并確定了細(xì)菌纖維素合成的重要影響因子的最優(yōu)水平，取得了較好的發(fā)酵效果，為進(jìn)一步提高其產(chǎn)量和后續(xù)的放大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。 1  材料 1.1  菌種來源葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter sp.）G-29，由本實(shí)驗(yàn)室課題組2008年從成

11、都市所采集的水果樣品中分離獲得，保存于四川大學(xué)生物資源與生態(tài)環(huán)境 教育 部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。1.2  培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，瓊脂18 g/L，pH6.0；種子培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，酵母膏15 g/L，Na2HPO4 3 g/L，MgSO4 0.2 g/L，乙醇40 ml/L，pH 6.0；用于響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.15 g/L，乙醇20 ml/L，pH 6.5；優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基：混合碳

12、源52.3 g/L（葡萄糖:蔗糖1:2），酵母膏8 g/L，F(xiàn)eSO4 0.2 g/L，MgSO4 0.159 g/L，Na2HPO4 2 g/L，檸檬酸1 g/L，乙醇32.5 ml/L，pH 6.5。1.3  培養(yǎng)條件挑取一環(huán)活化的斜面菌種至裝有100 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，30，110 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后按照8的接種量，將種子培養(yǎng)基接入裝有100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，8層紗布封口，30靜置培養(yǎng)7 d。 2  方法 2.1  細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量測(cè)定從培養(yǎng)基中取出纖維素膜，用水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)。再將膜

13、浸泡于0.1 mol/L的NaOH溶液，100煮沸20 min，去除液膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸餾水多次沖洗，用pH試紙輕壓膜測(cè)pH值，約7.2，80干燥至恒重。纖維素含量用g/L表示。2.2  發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方法Plackett-Burman設(shè)計(jì)、Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析。 3  結(jié)果 3.1  Plackett-Burman設(shè)計(jì)法篩選重要因素 根據(jù)筆者前期實(shí)驗(yàn)，本研究選取混合碳源（葡萄糖蔗糖=12），酵母膏，F(xiàn)eSO4，Na2HPO4，MgSO4，檸檬酸、乙醇作為PB試驗(yàn)的7個(gè)因素，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，因素水平及編

14、碼見表1，數(shù)據(jù)分析及模型建立由Design Expert軟件完成。表1  Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼（略）        根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的7因素12實(shí)驗(yàn)組合，依次進(jìn)行培養(yǎng)基的配制、接種、發(fā)酵試驗(yàn)(每組3個(gè)平行，取平均值)，以細(xì)菌纖維素干重為響應(yīng)值Y。結(jié)果如表2所示。    由表3可以看出，對(duì)G-29發(fā)酵合成能力影響最大的因素是混合碳源（葡萄糖/蔗糖=12），其次是乙醇和MgSO4。這3個(gè)因素對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響顯著，置信

15、度高于90%，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。而其它4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響未達(dá)到顯著水平，在下一步的研究中不予考慮。表2   Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)結(jié)果（略）表3  Plackett-Burman試驗(yàn)主效應(yīng)分析（略）3.2  重要因素與產(chǎn)量關(guān)系的2次方程的建立由Box-Behnken和Box-Wilson提出的中心組合設(shè)計(jì)是兩種常用的響應(yīng)面分析法，適用于25個(gè)因素的優(yōu)化試驗(yàn)。Box-Behnken每個(gè)因素取3種水平，以(-1，0，+1)編碼，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到帶交互相和平方相的二次方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，最后在一定的水

16、平范圍內(nèi)求出最佳值。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量有顯著性影響的3個(gè)因素的水平及編碼見表4。 表4Box-Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼  （略） 在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在最陡爬坡試驗(yàn)確定的濃度區(qū)域內(nèi)，對(duì)影響G-29合成細(xì)菌纖維素的關(guān)鍵因素按照Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行l(wèi)5組試驗(yàn)(每組3個(gè)平行，取平均值)，以細(xì)菌纖維素干重為響應(yīng)值Y。結(jié)果見表5。表5  Box-Behnken設(shè)計(jì)與細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（略）    利用統(tǒng)計(jì)軟件Minitab15對(duì)表5數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，獲得細(xì)菌纖維素產(chǎn)量(Y)對(duì)自變量葡萄糖/蔗糖(x1)，MgSO4 (

17、x2)，乙醇(x3)的多元回歸方程：Y=11.223 3+0.443 8X1+0.208 8X2+0.415 0X3-0.927 9X12-0.587 9X22-0.825 4X32-0.002 5X1X2-0.050 0X1X3+0.000 0X2X3    從該方程的方差分析(表6)可知，該模型極顯著(P<0.001)。確定系數(shù)R2=0.994 9，離回歸標(biāo)準(zhǔn)差S=0.098 6，說明回歸方程與實(shí)際擬合良好，可以用于細(xì)菌纖維素發(fā)酵的分析和預(yù)測(cè)。從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)(表7)可知，在模型參數(shù)中，X1，X2，X3，X12，X22，X32對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影

18、響都極顯著，而X1，X2，X3 這3個(gè)主效應(yīng)因子之間的交互作用對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響不顯著。表6  發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析表（略）3.3  響應(yīng)面分析及最佳培養(yǎng)條件確定通過回歸方程來繪制分析圖，考察所擬合的相應(yīng)曲面的形狀，響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高線圖見圖13。通過該組圖可對(duì)主效應(yīng)因子對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的兩兩交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，并確定各個(gè)因素的最佳水平范圍。表7  發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析表（略）由圖13可知，該回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值點(diǎn)，經(jīng)分析可知回歸模型的穩(wěn)定點(diǎn)的編碼值為：X1=5.232 3，X2=0.015 9，X3=3.252 5，相當(dāng)于葡

19、萄糖/蔗糖為5.232 3 g/100 ml，MgSO4 0.015 9 g/100 ml，乙醇3.252 5 ml/100 ml，在此最優(yōu)條件下，細(xì)菌纖維素的預(yù)測(cè)最大產(chǎn)量為11.347 g/L。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，用預(yù)測(cè)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，可得實(shí)際細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為11.83 g/L，是優(yōu)化前的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量(6.20 g/L)的1.9倍。由此，進(jìn)一步證明該回歸方程能夠真實(shí)的反映篩選因素對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，可用于預(yù)見實(shí)際發(fā)酵情況，對(duì)發(fā)酵條件的研究具有指導(dǎo)意義。.4  細(xì)菌纖維素形態(tài)與晶體結(jié)構(gòu)分析    細(xì)菌纖維素膜經(jīng)水沖洗和稀堿

20、液處理后，殘留的發(fā)酵液及菌體被除去后，細(xì)菌纖維素膜呈乳白色半透明膠狀（圖4），外表均勻光滑，質(zhì)地柔韌。經(jīng)干燥后，由電鏡掃描可觀察其微觀結(jié)構(gòu)為典型的超微細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖5)，由高密度微纖維進(jìn)行無規(guī)則的層狀重疊，互相纏繞形成。纖維素X-射線衍射圖譜是以衍射角為橫坐標(biāo)，衍射強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以晶胞(101)，(101)和(002)面的衍射峰為 計(jì)算 基準(zhǔn)。由圖6可以看出，干膜的衍射圖分別在14.94  2和22.45  2處有兩個(gè)主要的衍射峰，這是纖維素I的特征峰，即細(xì)菌纖維素的晶體結(jié)構(gòu)屬于纖維素I。其中2為22.45處的衍射峰對(duì)應(yīng)晶面(002)，在纖維素X-射線衍射圖譜中，2值在22

21、.50附近的峰高代表了002面的衍射強(qiáng)度，即結(jié)晶區(qū)的強(qiáng)度。由衍射圖譜可看出，G-29合成的細(xì)菌纖維素，結(jié)晶指數(shù)高，結(jié)晶強(qiáng)度大。而圖7則反映了濕膜的衍射峰，只在28.5 2和42 2處有衍射峰，沒有呈現(xiàn)出纖維素I的衍射峰，表明濕態(tài)的晶面面間距比干態(tài)的小。這兩個(gè)峰的峰寬比干態(tài)下大，表明其結(jié)晶不完全，結(jié)晶度低，晶粒尺寸小。可能是由于細(xì)菌纖維素濕膜含有大量的水，導(dǎo)致纖維素分子鏈之間的距離增大，在水分子與纖維素鏈的相互作用下，纖維素分子鏈之間的氫鍵模式發(fā)生改變，從而影響了細(xì)菌纖維素膜的晶型和晶粒尺寸，導(dǎo)致其的結(jié)晶度變低。 4  結(jié)論     本實(shí)驗(yàn)采用了Plack

22、ett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響菌株G-29合成細(xì)菌纖維素的7個(gè)因素進(jìn)行了評(píng)價(jià)，篩選出了混合碳源（葡萄糖蔗糖=12），乙醇和MgSO4為影響細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的關(guān)鍵因子。葡萄糖是合成細(xì)菌纖維素的原料，蔗糖可以緩解發(fā)酵過程中pH值的急劇降低；乙醇可以被細(xì)菌氧化為乙酸，同時(shí)生成用于細(xì)胞合成的ATP等高能量化合物7，對(duì)細(xì)菌纖維素的合成起促進(jìn)作用，而MgSO4中的Mg2+是纖維素合成酶的激活劑。因此，以PB試驗(yàn)篩選出的主要影響因子能夠反映實(shí)際情況，證明該方法是一種 經(jīng)濟(jì) 而有效的試驗(yàn)方法。    通過響應(yīng)面法(RSM)建立了細(xì)菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的回歸模型：Y=11.223

23、 3+0.443 8X1+0.208 8X2+0.415 0X3-0.927 9X12-0.587 9X22-0.825 4X32-0.002 5X1X2-0.050 0X1X3+0.000 0X2X3該模型高度顯著，可用于實(shí)際分析與預(yù)測(cè)。    優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成：混合碳源52.3 g/L（葡萄糖蔗糖12），酵母膏8 g/L，F(xiàn)eSO4 0.2 g/L，MgSO4 0.159 g/L，Na2HPO4 2 g/L，檸檬酸1g/L，乙醇32.5 ml/L，此條件下的發(fā)酵產(chǎn)量是優(yōu)化前的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)量(6.20 g/L)的1.9倍，表明Plackett-Burm

24、an試驗(yàn)和響應(yīng)面相結(jié)合的試驗(yàn)方法用于優(yōu)化G-29發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅 科學(xué) 合理而且準(zhǔn)確有效。    細(xì)菌纖維素具有超微結(jié)構(gòu)，濕膜的固形物含量低，持水性高，結(jié)晶不完全；干燥后結(jié)構(gòu)致密，抗拉強(qiáng)度高，結(jié)晶指數(shù)高，結(jié)晶強(qiáng)度大。 【 參考 文獻(xiàn) 】   1Peter Ross, Raphael Mayer, Moshe Benziman. Cellulose biosynthesis and function in bacteriaJ. Microbiological Reviews,1991,55(1):35.2Choi Yong-Jin, Ahn Yeonghee, Kang Moon