蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)學(xué)ppt課件

1、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)Medical Molecular Biology第第2章章_第第3節(jié)節(jié)蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組及蛋白質(zhì)組學(xué)Proteome& Proteomics 從基因組學(xué)到蛋白質(zhì)組學(xué) -人類邁入后基因組時代human genome project，結(jié)構(gòu)基因組學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)功能基因組學(xué)功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)概況蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)概況基因基因蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)功能功能作用行為作用行為蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組一組一組一群一群一系列一系列RNA蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)Protemics轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白質(zhì)組的含義蛋白質(zhì)組的含義o 蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組 o protein + genom

2、e proteomeo 一種基因組所表達的全部蛋白質(zhì)一種基因組所表達的全部蛋白質(zhì)o 一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì)一個細胞或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組及蛋白組學(xué)出現(xiàn)的必要性蛋白質(zhì)組及蛋白組學(xué)出現(xiàn)的必要性lDNA序列信息的不可預(yù)測：序列信息的不可預(yù)測： 1）基因表達產(chǎn)物是否或何時被翻譯；）基因表達產(chǎn)物是否或何時被翻譯； 2）基因產(chǎn)物相應(yīng)含量；）基因產(chǎn)物相應(yīng)含量； 3）翻譯后修飾程度；）翻譯后修飾程度； 4）基因剔除或過表達影響；）基因剔除或過表達影響； 5）遺留的小基因或）遺留的小基因或300 bp的的ORFs出現(xiàn)；出現(xiàn)； 6）多基因現(xiàn)象表型。）多基因現(xiàn)象表型。lmRN

3、A水平的測量并不能完全揭示細胞調(diào)節(jié)行為水平的測量并不能完全揭示細胞調(diào)節(jié)行為 1）蛋白質(zhì)和）蛋白質(zhì)和mRNA之間的相關(guān)系數(shù)僅為之間的相關(guān)系數(shù)僅為0.40.5； 2）蛋白質(zhì)的樣品較）蛋白質(zhì)的樣品較mRNA 穩(wěn)定；穩(wěn)定； 3）存在轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)節(jié)以及翻譯后加工等。）存在轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)節(jié)以及翻譯后加工等。l蛋白質(zhì)本身的多樣性和可變性蛋白質(zhì)本身的多樣性和可變性 1）蛋白質(zhì)種類和數(shù)量在同一機體、不同細胞中是各不相同的。）蛋白質(zhì)種類和數(shù)量在同一機體、不同細胞中是各不相同的。 2）同一細胞，在不同時期、不同條件下，蛋白質(zhì)組也在不斷改變。）同一細胞，在不同時期、不同條件下，蛋白質(zhì)組也在不斷改變。 3）在

4、病理或治療過程中，細胞蛋白質(zhì)組成及其變化與正常生理過程不同。）在病理或治療過程中，細胞蛋白質(zhì)組成及其變化與正常生理過程不同。蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)o 闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式o 從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾和構(gòu)象的變化狀態(tài)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾和構(gòu)象的變化狀態(tài)o 了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系, ,揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)律揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)

5、律p 在整體水平上研究細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)及其代謝規(guī)律；n 蛋白質(zhì)的種類、水平、修飾和構(gòu)象的變化總蛋白質(zhì)的種類、水平、修飾和構(gòu)象的變化總是處于一個新陳代謝的動態(tài)過程中。是處于一個新陳代謝的動態(tài)過程中。n 研究細胞內(nèi)與某個功能有關(guān)或在某種條件下研究細胞內(nèi)與某個功能有關(guān)或在某種條件下的一組蛋白質(zhì)。的一組蛋白質(zhì)。功能蛋白質(zhì)組功能蛋白質(zhì)組1）整體性和規(guī)模化：）整體性和規(guī)?；旱鞍踪|(zhì)功能的發(fā)揮依賴其整體性（蛋白質(zhì)群）的發(fā)揮。蛋白質(zhì)組的大規(guī)模研究（主要蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮依賴其整體性（蛋白質(zhì)群）的發(fā)揮。蛋白質(zhì)組的大規(guī)模研究（主要集中在蛋白質(zhì)表達模式或蛋白質(zhì)組成研究）集中在蛋白質(zhì)表達模式或蛋白質(zhì)組成研究

6、）；2）動態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)化：）動態(tài)性和網(wǎng)絡(luò)化：蛋白質(zhì)在機體中具有時空性，是動態(tài)的，故需要蛋白質(zhì)的相互作用研究及蛋白質(zhì)代謝蛋白質(zhì)在機體中具有時空性，是動態(tài)的，故需要蛋白質(zhì)的相互作用研究及蛋白質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)研究（蛋白質(zhì)功能模式）；網(wǎng)絡(luò)研究（蛋白質(zhì)功能模式）；3）復(fù)雜性和綜合技術(shù)化：）復(fù)雜性和綜合技術(shù)化：蛋白質(zhì)功能發(fā)揮是極其復(fù)雜的調(diào)控過程，需要多種技術(shù)，如雙向凝膠、雙向?qū)游觥①|(zhì)蛋白質(zhì)功能發(fā)揮是極其復(fù)雜的調(diào)控過程，需要多種技術(shù)，如雙向凝膠、雙向?qū)游?、質(zhì)譜、雙雜交系統(tǒng)、生物芯片等技術(shù)的綜合應(yīng)用譜、雙雜交系統(tǒng)、生物芯片等技術(shù)的綜合應(yīng)用蛋白組學(xué)研究的特點蛋白組學(xué)研究的特點蛋白質(zhì)組研究常用技術(shù)蛋白質(zhì)組研究常用技術(shù)1）

7、蛋白質(zhì)分離技術(shù)（電泳和層析技術(shù)）：）蛋白質(zhì)分離技術(shù)（電泳和層析技術(shù)）：雙向凝膠電泳（雙向凝膠電泳（2-DE）、雙向）、雙向“高效高效”柱層析等。柱層析等。2）蛋白質(zhì)檢測與圖像分析以及鑒定技術(shù)：）蛋白質(zhì)檢測與圖像分析以及鑒定技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)、凝膠圖像分析、質(zhì)譜技術(shù)、凝膠圖像分析、N端與端與C端測序技術(shù)、蛋白質(zhì)差異分析技術(shù)等。端測序技術(shù)、蛋白質(zhì)差異分析技術(shù)等。3）蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)：）蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)：酵母雙雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)，噬菌體展示技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)，表面等離子技酵母雙雜交系統(tǒng)和反向雜交系統(tǒng)，噬菌體展示技術(shù)，免疫共沉淀技術(shù)，表面等離子技術(shù)，熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，蛋白質(zhì)定點突變技術(shù)等術(shù)，熒光

8、能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，蛋白質(zhì)定點突變技術(shù)等4）生物信息學(xué)分析技術(shù)：）生物信息學(xué)分析技術(shù)：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫技術(shù)、序列比對等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫技術(shù)、序列比對等1）蛋白質(zhì)的分離與分析）蛋白質(zhì)的分離與分析2）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的研究）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的研究3）蛋白質(zhì)核酸相互作用的研究）蛋白質(zhì)核酸相互作用的研究蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和范疇蛋白質(zhì)組學(xué)研究的內(nèi)容和范疇蛋白質(zhì)組學(xué)和醫(yī)學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)和醫(yī)學(xué)1）人類疾病的蛋白質(zhì)組研究）人類疾病的蛋白質(zhì)組研究 惡性腫瘤：惡性腫瘤： Sanchez通過蛋白質(zhì)組研究建立了通過蛋白質(zhì)組研究建立了800多個斑點的結(jié)腸癌多個斑點的結(jié)腸癌及正常人結(jié)腸粘膜的標準膠圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量為及正常人結(jié)

9、腸粘膜的標準膠圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量為13kD和和pI值為值為5.6處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。這表明處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。這表明該蛋白的出現(xiàn)對檢測早期直腸癌有很強提示。通過對該蛋該蛋白的出現(xiàn)對檢測早期直腸癌有很強提示。通過對該蛋白白HPLC及測序等分析后，發(fā)現(xiàn)與鈣粒蛋白及測序等分析后，發(fā)現(xiàn)與鈣粒蛋白B（calgranulin B）及鈣衛(wèi)蛋白（）及鈣衛(wèi)蛋白（calprotectin）有很大關(guān)系。有很大關(guān)系。2）致病微生物的蛋白質(zhì)組研究）致病微生物的蛋白質(zhì)組研究 弓形體抗原的檢測：弓形體抗原的檢測：弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄生蟲病。全球人口大約有弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄

10、生蟲病。全球人口大約有30%是攜帶者，是攜帶者，在歐洲是最常見的寄生蟲病。大約在歐洲是最常見的寄生蟲病。大約50%母體的感染可引起新生兒先天性疾病。母體的感染可引起新生兒先天性疾病。因此診斷及治療越早越好。因此診斷及治療越早越好。目前要依靠血清學(xué)及目前要依靠血清學(xué)及PCR，而單獨采用血清學(xué)如用，而單獨采用血清學(xué)如用IgG，IgM,或或IgA抗體對疾抗體對疾病活動期敏感性不夠，尤其對于妊娠或有免疫抑制的患者。潛在感染常發(fā)生病活動期敏感性不夠，尤其對于妊娠或有免疫抑制的患者。潛在感染常發(fā)生在有免疫抑制的患者中。對在有免疫抑制的患者中。對AIDS患者來說，鼠弓形體蟲是最主要的致命性腦患者來說，鼠弓形

11、體蟲是最主要的致命性腦損傷的病因。因此，能否早期診斷對治療來說尤為關(guān)鍵。損傷的病因。因此，能否早期診斷對治療來說尤為關(guān)鍵。3）致病菌耐藥性研究）致病菌耐藥性研究在白色念珠菌中，目前發(fā)現(xiàn)至少有在白色念珠菌中，目前發(fā)現(xiàn)至少有8種種CDR家族的基因可產(chǎn)生耐藥株的表現(xiàn)型。家族的基因可產(chǎn)生耐藥株的表現(xiàn)型。且有且有55種基因分別表達種基因分別表達ABC及及MFS蛋白（菌內(nèi)藥物輸出泵）。蛋白（菌內(nèi)藥物輸出泵）。應(yīng)用應(yīng)用2-DE、免疫檢測蛋白質(zhì)等技術(shù)，對這些蛋白在菌內(nèi)的表達量進行分析，、免疫檢測蛋白質(zhì)等技術(shù)，對這些蛋白在菌內(nèi)的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Cdrlp及及CaMdrlp蛋白在耐咪唑類菌株中過量表達。蛋

12、白在耐咪唑類菌株中過量表達。同時，對敏感性及耐藥株蛋白質(zhì)的同時，對敏感性及耐藥株蛋白質(zhì)的2-DE圖分析發(fā)現(xiàn)，在耐藥菌中有圖分析發(fā)現(xiàn)，在耐藥菌中有25種蛋白種蛋白質(zhì)增加，有質(zhì)增加，有76種蛋白質(zhì)減少。推測白色念株菌是通過改變?nèi)旧w數(shù)目或染色種蛋白質(zhì)減少。推測白色念株菌是通過改變?nèi)旧w數(shù)目或染色體重組來調(diào)節(jié)基因的表達量，進而產(chǎn)生耐藥性。體重組來調(diào)節(jié)基因的表達量，進而產(chǎn)生耐藥性。 一、分離純化一、分離純化 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析二、分析鑒定二、分析鑒定一、一、 分分 離離 純純 化化 （二）破碎細胞（二）破碎細胞 （三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法（三）蛋白質(zhì)混合物的分離

13、方法 （四）蛋白質(zhì)分離純化的條件（四）蛋白質(zhì)分離純化的條件 （一）選擇材料（一）選擇材料 o 目的蛋白質(zhì)的含量目的蛋白質(zhì)的含量o 提取蛋白質(zhì)的材料提取蛋白質(zhì)的材料一、分一、分 離離 純純 化化 （一）選擇材料（一）選擇材料 一、分一、分 離離 純純 化化（二）破碎細胞（二）破碎細胞 o 機械法機械法o 物理法物理法o 化學(xué)法化學(xué)法 根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性 質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進行：質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進行： 1.1.根據(jù)溶解度根據(jù)溶解度 2.2.根據(jù)分子量根據(jù)分子量 透析和超濾透析和超濾 平衡離心平衡離心 凝膠過濾層析凝膠過濾層析 （三

14、）蛋白質(zhì)混合物的分離方法（三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法一、分一、分 離離 純純 化化3.3.根據(jù)電荷根據(jù)電荷 毛細管電泳毛細管電泳 離子交換層析離子交換層析4.4.根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力 親和層析親和層析一、分一、分 離離 純純 化化（四）（四） 蛋白質(zhì)分離純化的條件蛋白質(zhì)分離純化的條件o 緩沖液緩沖液o 鹽、金屬離子和螯合劑鹽、金屬離子和螯合劑o 還原劑還原劑o 去垢劑去垢劑o 蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑 表面效應(yīng)表面效應(yīng)o 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 溫度溫度 儲存儲存o 一、一、 分分 離離 純純 化化二、分析鑒定二、分析鑒定 （三）圖像分析技術(shù)（三）圖像分析技術(shù)（四

15、）放射性核素標記親和標簽法（四）放射性核素標記親和標簽法（五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（六）質(zhì)譜技術(shù)（六）質(zhì)譜技術(shù) （一）（一）WesternWestern印跡技術(shù)印跡技術(shù) （二）二維凝膠電泳（二）二維凝膠電泳（2-DE2-DE）技術(shù)）技術(shù)（七）其它方法（七）其它方法二、分析鑒定二、分析鑒定（一）（一）WesternWestern印跡技術(shù)印跡技術(shù)基本操作步驟：基本操作步驟： 蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備 SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng)蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標蛋白質(zhì)的顯示目標蛋白質(zhì)的顯示western weste

16、rn 印跡基本步驟圖示印跡基本步驟圖示（二）二維凝膠電泳（二）二維凝膠電泳（2-DE)2-DE)技術(shù)技術(shù)o 目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一o 由兩相組成：由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳第一相：等電聚焦凝膠電泳 ( (根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異) ) 第二相：第二相：SDSSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 ( (根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異) )二、分析鑒定二、分析鑒定二、分析鑒定二、分析鑒定2-DE 技術(shù)原理技術(shù)原理2-DE2-DE分析的基本步驟分析的基本步驟蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)溶解溶解變性變性還原還原去除蛋

17、白去除蛋白質(zhì)雜志質(zhì)雜志利用不同利用不同pKpK固定化固定化電解質(zhì)配電解質(zhì)配置不同置不同pHpH范圍的凝范圍的凝膠膠利用軟件利用軟件設(shè)計配置設(shè)計配置 第一相電泳第一相電泳(IPG(IPGIFE)IFE)平衡平衡第二相電泳第二相電泳(SDS(SDSPAGE)PAGE)考馬斯亮考馬斯亮藍染色藍染色銀染色銀染色銅染色銅染色樣品制備樣品制備IPGIPG膠制備膠制備雙相電泳雙相電泳染色染色二、分析鑒定二、分析鑒定2-DE2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜獲得的蛋白質(zhì)圖譜二、分析鑒定二、分析鑒定 通過通過2-DE2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有

18、不同灰度強像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。 ( (三三) )圖像分析技術(shù)圖像分析技術(shù)二、分析鑒定二、分析鑒定 2-DE2-DE圖像分析軟件包操作過程：圖像分析軟件包操作過程： 圖像采集圖像采集斑點檢測斑點檢測背景消減背景消減獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息圖像內(nèi)及圖像間的比較圖像內(nèi)及圖像間的比較二、分析鑒定二、分析鑒定 （四）放射性核素標記親和標簽法（四）放射性核素標記親和標簽法正常細胞正常細胞 D0D0親和標簽親和標簽病理細胞病理細胞 D8D8親和標簽親和標簽混合并消化混合并消化生物素親和純化生物素親和純化液相色

19、譜質(zhì)譜聯(lián)用分析液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析測量兩個不同樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度測量兩個不同樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度二、分析鑒定二、分析鑒定（五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（五）蛋白質(zhì)芯片技術(shù)二、分析鑒定二、分析鑒定o 原理原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和電樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和電荷比值（荷比值（m/em/e）的差異確定分子量。）的差異確定分子量。o 應(yīng)用應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析蛋白質(zhì)的序列分析 研究蛋白質(zhì)的修飾研究蛋白質(zhì)的修飾（六）質(zhì)譜技術(shù)（六）質(zhì)譜技術(shù)二、分析鑒定二、分析鑒定 （七）（七） 其它方法其它方法o EdmanEdman降解法測定蛋白質(zhì)多肽的排列順序降解法測定蛋白質(zhì)多肽的排列

20、順序o 核磁共振（核磁共振（NMRNMR）、熒光光譜法測定溶液中蛋白質(zhì)熒光光譜法測定溶液中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)分子的結(jié)構(gòu)o X X射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等二、分析鑒定二、分析鑒定2. 蛋白組學(xué)研究技術(shù)蛋白組學(xué)研究技術(shù)2.1.蛋白質(zhì)樣品分離技術(shù)蛋白質(zhì)樣品分離技術(shù)細胞裂解與蛋白質(zhì)溶解細胞裂解與蛋白質(zhì)溶解 ，去除核酸等非蛋白質(zhì)成分。，去除核酸等非蛋白質(zhì)成分。l激光捕獲顯微切割激光捕獲顯微切割 (Laser-captured micro dissection，LCM)：通過低能紅外激光脈沖激活熱塑膜通過低能紅外激光脈沖

21、激活熱塑膜-乙烯乙酸乙烯酯膜乙烯乙酸乙烯酯膜（最大（最大吸收峰接近紅外激光波長）吸收峰接近紅外激光波長），在直視下選擇性地將目標細胞或組，在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上，從而取出細胞或組織。織碎片粘到該膜上，從而取出細胞或組織。l分離細胞速度快，無需精巧的分離細胞速度快，無需精巧的操作技能；操作技能；l捕獲細胞和剩余組織，其形態(tài)捕獲細胞和剩余組織，其形態(tài)學(xué)特征保持完好，可較好地控制學(xué)特征保持完好，可較好地控制捕獲細胞的特異性；捕獲細胞的特異性；l捕獲細胞與塑料帽結(jié)合緊密，捕獲細胞與塑料帽結(jié)合緊密， 減少了組織損失風(fēng)險。減少了組織損失風(fēng)險。l廣泛應(yīng)用于腫瘤研究廣泛應(yīng)用于腫瘤研究優(yōu)

22、點優(yōu)點缺點缺點l不適合常規(guī)染色組織；不適合常規(guī)染色組織；l不適合缺乏結(jié)構(gòu)特點的組織不適合缺乏結(jié)構(gòu)特點的組織（可（可結(jié)合免疫組化）；結(jié)合免疫組化）；l捕獲細胞與塑料帽結(jié)合緊密，捕獲細胞與塑料帽結(jié)合緊密， 減少了組織損失風(fēng)險。減少了組織損失風(fēng)險。2.2.蛋白質(zhì)的分離技術(shù)蛋白質(zhì)的分離技術(shù)A、雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳（ Two-dimensional Gel Electrophoresis, 2-DE）第一向：等電聚焦凝膠電泳第一向：等電聚焦凝膠電泳（Isoelectric Focusing Gel Electrophoresis, IEF）:以蛋白質(zhì)電荷差異進行分離；以蛋白質(zhì)電荷差異進行分離；第二向

23、：第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：）：蛋白質(zhì)分子量差異進蛋白質(zhì)分子量差異進行分離。行分離。等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一等電聚焦中，蛋白質(zhì)分子在含有載體兩性電解質(zhì)形成的一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度梯度電泳。電泳。分離原理：分離原理：蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的蛋白質(zhì)分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電條件下帶有電荷，可在電場中移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，荷，可在電場中移動；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點位置時，其靜電荷數(shù)為零，不再移動，蛋白質(zhì)分離。其靜電荷數(shù)為零，不再移動，蛋白質(zhì)分離。l等電聚焦凝膠電泳等電聚焦凝膠

24、電泳載體：載體：丙烯酰胺衍生物丙烯酰胺衍生物+丙烯酰胺丙烯酰胺正極：正極：弱酸弱酸負極：負極：弱堿弱堿固相固相pH梯度梯度(固定、不隨電場變化、重復(fù)性好固定、不隨電場變化、重復(fù)性好)IPG（Immobilized pH gradient）載體：載體：脂肪族多氨基多羧酸化合物脂肪族多氨基多羧酸化合物正極：正極：弱酸弱酸負極：負極：弱弱堿堿液相液相pH梯度梯度（連續(xù)兩性緩沖離子液）（連續(xù)兩性緩沖離子液）LPG（Liquid pH gradient）1：樣品制備保護：樣品制備保護等電聚焦對蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感等電聚焦對蛋白質(zhì)的電荷差異非常敏感，樣品制備應(yīng)避免任何形式的蛋白質(zhì)化，樣品制備應(yīng)避免任何

25、形式的蛋白質(zhì)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)修飾學(xué)組成和結(jié)構(gòu)修飾2：變性電泳：變性電泳(通常加入尿素通常加入尿素)蛋白質(zhì)脂類、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作蛋白質(zhì)脂類、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用可引起電荷改變，進而導(dǎo)致等電點遷用可引起電荷改變，進而導(dǎo)致等電點遷移或紋理現(xiàn)象移或紋理現(xiàn)象3：穩(wěn)定電泳：穩(wěn)定電泳PH梯度：梯度：固相固相PH梯度等電聚焦電泳（梯度等電聚焦電泳（IPG-IEF)：弱酸或弱堿的丙烯酰胺衍生物，凝聚時弱酸或弱堿的丙烯酰胺衍生物，凝聚時形成穩(wěn)定形成穩(wěn)定PH梯度，分辨率梯度，分辨率0.001pH、上、上樣量比較大、易于自動化、重復(fù)性好。樣量比較大、易于自動化、重復(fù)性好。IPG等點聚焦電泳設(shè)備等點聚焦電泳設(shè)備等電聚焦

26、電泳要求等電聚焦電泳要求LPG等點聚焦電泳設(shè)備等點聚焦電泳設(shè)備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（垂直板電泳）：聚丙烯酰胺凝膠電泳（垂直板電泳）：SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子去污劑，它能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子去污劑，它能與蛋白質(zhì)的疏水部分結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)獲得大量的負電荷，而掩蓋蛋白質(zhì)本身的電荷，使蛋白質(zhì)在從而使蛋白質(zhì)獲得大量的負電荷，而掩蓋蛋白質(zhì)本身的電荷，使蛋白質(zhì)在PAG中電泳時的遷移率只與分子大小相關(guān)。中電泳時的遷移率只與分子大小相關(guān)。2-DE的基本步驟：的基本步驟：樣品制備樣品制備IPG膠的制備雙向電泳蛋白質(zhì)染色膠的制備雙向電泳蛋白質(zhì)染色 1）樣品制備）

27、樣品制備：蛋白質(zhì)溶解液包括蛋白質(zhì)溶解液包括 8mol/L尿素，尿素， 4%CHAPS，50100mmol/L DTT，40mol/Ltris。增溶劑如。增溶劑如2mol/L硫脲。還原劑磷酸三丁酯（硫脲。還原劑磷酸三丁酯（TBP）。蛋白酶抑）。蛋白酶抑制劑如苯甲基硫酰氟、制劑如苯甲基硫酰氟、EDTA等。等。2）IPG膠的制備：膠的制備：選擇選擇pH范圍范圍3）雙向電泳：）雙向電泳：兩向緩沖液不同，細胞提取液的雙向電泳可以分辨出兩向緩沖液不同，細胞提取液的雙向電泳可以分辨出10002000個蛋白質(zhì)，個蛋白質(zhì)，有些報道可以分辨出有些報道可以分辨出500010000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)

28、量個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質(zhì)數(shù)量接近。接近。4）蛋白質(zhì)染色：）蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍、銀染（考馬斯亮藍、銀染（2-5ng)、熒光染色。、熒光染色。優(yōu)點：根據(jù)電荷差異和分子大小分離蛋白，優(yōu)點：根據(jù)電荷差異和分子大小分離蛋白，故能分離分子電荷相同但分子大小不故能分離分子電荷相同但分子大小不同或者同分異構(gòu)體（分子量相同但構(gòu)象不同）以及經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白（如電荷數(shù)不同或者同分異構(gòu)體（分子量相同但構(gòu)象不同）以及經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白（如電荷數(shù)不同的磷酸化蛋白質(zhì)與非磷酸化蛋白，在雙向電泳膠上出現(xiàn)一串水平斑點同的磷酸化蛋白質(zhì)與非磷酸化蛋白，在雙向電泳膠上出現(xiàn)一串水平斑點 ）。）。缺點：缺點：不能分離

29、疏水性及強酸強堿性蛋白；不能分離低豐度蛋白；靈敏度受不能分離疏水性及強酸強堿性蛋白；不能分離低豐度蛋白；靈敏度受樣品量限制及染色效果影響（不同與染料結(jié)合程度不同）；不能完全自動化，樣品量限制及染色效果影響（不同與染料結(jié)合程度不同）；不能完全自動化，耗時較長耗時較長2-DE優(yōu)缺點優(yōu)缺點差異凝膠電泳差異凝膠電泳 (Differences Gel Electrophoresis)將兩種蛋質(zhì)樣品分別用相同染料進行熒光標記，混合后在同一膠塊上進行雙向電泳。將兩種蛋質(zhì)樣品分別用相同染料進行熒光標記，混合后在同一膠塊上進行雙向電泳。毛細管電泳毛細管電泳 (Capillary Electrophoresis，

30、CE)在高電場強度作用下，對毛細管在高電場強度作用下，對毛細管 (內(nèi)徑內(nèi)徑 510 m)中的待測樣品按分子質(zhì)量中的待測樣品按分子質(zhì)量 、電荷、電荷 、電泳遷移率等差異進行、電泳遷移率等差異進行有效分離。有效分離。高效液相色譜高效液相色譜 (High-performance liquid chromatography，HPLC)對單一蛋白或簡樣品蛋白質(zhì)組進行分離與純化。若與質(zhì)譜結(jié)合對單一蛋白或簡樣品蛋白質(zhì)組進行分離與純化。若與質(zhì)譜結(jié)合 ，可利用蛋白質(zhì)等電點，可利用蛋白質(zhì)等電點 、疏水件和分子量等特性，借助計算機聯(lián)機檢索，可對、疏水件和分子量等特性，借助計算機聯(lián)機檢索，可對蛋白質(zhì)進行一次性分離和鑒

31、定，滿足高通量蛋白質(zhì)進行一次性分離和鑒定，滿足高通量 、自動化分析要求。其主要適宜于膜蛋白及低豐度蛋白質(zhì)的分離鑒定，在實際操作中利用蛋白質(zhì)不、自動化分析要求。其主要適宜于膜蛋白及低豐度蛋白質(zhì)的分離鑒定，在實際操作中利用蛋白質(zhì)不同特性同特性 ，可進行多個分離柱多次高效液相分離，從而得到多維色譜。，可進行多個分離柱多次高效液相分離，從而得到多維色譜。2.2.3 蛋白質(zhì)檢測與圖像分析技術(shù)蛋白質(zhì)檢測與圖像分析技術(shù)l蛋白質(zhì)染色及檢測蛋白質(zhì)染色及檢測（1）考馬斯亮藍染考（）考馬斯亮藍染考（CBB G/R-250）（2）銀染色）銀染色將蛋白上多附著的硝酸銀將蛋白上多附著的硝酸銀(銀離子銀離子 )還原成金屬銀

32、還原成金屬銀 ，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上，以使銀顆粒沉積在蛋白帶上 。其靈敏度比考馬斯亮藍染色高其靈敏度比考馬斯亮藍染色高 100倍倍 ，可以檢測，可以檢測 0.38ng/mm 的牛血清白蛋白。的牛血清白蛋白。（3）熒光染色）熒光染色（4）麗春紅染色）麗春紅染色 （5）氨基黑）氨基黑10B染色染色（6）印度紅染色）印度紅染色最常用最常用特殊條件下使用特殊條件下使用成像成像軟件定量分析蛋白質(zhì)點軟件定量分析蛋白質(zhì)點（pI、分子量、密度）、分子量、密度）定位熱點蛋白質(zhì)點定位熱點蛋白質(zhì)點精確切割膠內(nèi)蛋白質(zhì)點精確切割膠內(nèi)蛋白質(zhì)點酶切消化膠塊酶切消化膠塊脫鹽脫鹽/濃縮處理消化物濃縮處理消化物轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移

33、蛋白質(zhì)（特定材料載體）（特定材料載體）質(zhì)譜系統(tǒng)分析質(zhì)譜系統(tǒng)分析l圖像及分析技術(shù)圖像及分析技術(shù)凝膠成像儀凝膠成像儀58PH8200KDal問題：問題：太多蛋白斑點串（氨基甲?；瘜?dǎo)致，非常規(guī)磷酸化等修飾）。太多蛋白斑點串（氨基甲?；瘜?dǎo)致，非常規(guī)磷酸化等修飾）。l可能原因：可能原因：尿素不純。尿素不純。l建議：建議：避免樣品加熱，用純度更高的尿素或者用避免樣品加熱，用純度更高的尿素或者用Amberlite IRN-150L去異氰酸鹽去異氰酸鹽電泳過程中的一些問題分析電泳過程中的一些問題分析常規(guī)標準裂解液，常規(guī)標準裂解液，樣品溶解不充分樣品溶解不充分用甲醇沉淀后復(fù)溶，用甲醇沉淀后復(fù)溶，效果也不明顯效果

34、也不明顯TCA/丙酮沉淀較適合丙酮沉淀較適合不同的樣品制備步驟導(dǎo)致完全不同的蛋白斑點圖譜不同的樣品制備步驟導(dǎo)致完全不同的蛋白斑點圖譜 l問題：問題：蛋白丟失蛋白丟失l問題：問題： 蛋白丟失蛋白丟失l可能原因：可能原因：蛋白轉(zhuǎn)移電壓過高（如蛋白轉(zhuǎn)移電壓過高（如400V，18cm膠），在膠），在開始的開始的45分鐘內(nèi)不要超過分鐘內(nèi)不要超過2W/gel（Ettan size） l問題：問題：水平條帶（樣品含高豐度蛋白）水平條帶（樣品含高豐度蛋白）l可能原因：可能原因：高豐度蛋白聚集后，若采用膠面朝下的高豐度蛋白聚集后，若采用膠面朝下的膠條槽，易造成水平條帶。膠條槽，易造成水平條帶。l建議：建議：采用

35、杯上樣膠條槽或采用杯上樣膠條槽或manifold等膠面朝上的等膠面朝上的膠條槽。膠條槽。l問題：問題： 過多水平條帶（窄過多水平條帶（窄pH范圍膠條）范圍膠條）l可能原因：可能原因：聚焦不夠，或者鹽離子過多聚焦不夠，或者鹽離子過多l(xiāng)其它原因：其它原因：Detergent去污劑濃度過低去污劑濃度過低 尿素濃度過低，空氣中的尿素濃度過低，空氣中的CO2 DTT濃度過低，或者用量過少濃度過低，或者用量過少 上樣位置不合適（比如上樣位置不合適（比如cup loading） 蛋白酶活性，膠條溶脹時間過短蛋白酶活性，膠條溶脹時間過短 樣品中含有不溶的蛋白樣品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr

36、 / 40,000 g) l問題：問題：試劑不新鮮試劑不新鮮l可能原因：可能原因：TEMED不新鮮。不新鮮。l建議：建議：換新鮮試劑換新鮮試劑l問題：問題：斑點擴散斑點擴散l可能原因：可能原因：第二向凝膠時溫度太低，第二向凝膠時溫度太低， SDS有沉有沉淀淀l建議：建議：長時間保存（長時間保存（2d - 2weeks）在）在48C， 在二向進行前應(yīng)提前把凝膠取出，室溫放置。在二向進行前應(yīng)提前把凝膠取出，室溫放置。l問題：問題：考馬氏亮藍染色考馬氏亮藍染色l可能原因：可能原因：多糖未去除干凈，被染色多糖未去除干凈，被染色l建議：建議：樣品用樣品用clean-up處理處理 l問題：問題：等電聚焦失

37、敗等電聚焦失敗l可能原因：可能原因：樣品中含鹽等離子雜質(zhì)過高樣品中含鹽等離子雜質(zhì)過高l建議：建議：除去鹽離子，如在洗細胞時要把除去鹽離子，如在洗細胞時要把PBS在在離心后徹底移除，或在最后一步清洗時采用離心后徹底移除，或在最后一步清洗時采用250mM蔗糖蔗糖/10mM Tris 洗細胞。洗細胞。l問題：問題： 蛋白斑點出現(xiàn)垂直條帶蛋白斑點出現(xiàn)垂直條帶l可能原因：可能原因：平衡過程中平衡過程中DTT不足，導(dǎo)致一些不足，導(dǎo)致一些蛋白出現(xiàn)垂直條帶蛋白出現(xiàn)垂直條帶。 l問題：問題：白斑點成像不佳（試劑質(zhì)量影響）白斑點成像不佳（試劑質(zhì)量影響）l可能原因：可能原因：Tris質(zhì)量不好質(zhì)量不好l 分子物理特性

38、鑒定分子物理特性鑒定：（分子大小、性質(zhì)、序列組成及結(jié)構(gòu)等）：（分子大小、性質(zhì)、序列組成及結(jié)構(gòu)等）l相對分子量大?。合鄬Ψ肿恿看笮。嘿|(zhì)譜質(zhì)譜l序列測定：序列測定：N/C端測序，毛細管電泳測序端測序，毛細管電泳測序l結(jié)構(gòu)鑒定：結(jié)構(gòu)鑒定：光譜、光譜、X衍射和生物信息計算預(yù)測衍射和生物信息計算預(yù)測2.2.蛋白質(zhì)的鑒定蛋白質(zhì)的鑒定2.2.1 質(zhì)量鑒定技術(shù)質(zhì)量鑒定技術(shù)蛋白質(zhì)被酶切位點專一的蛋白酶水解后蛋白質(zhì)被酶切位點專一的蛋白酶水解后 ，產(chǎn)生不同序列長，產(chǎn)生不同序列長度的肽段。這些肽段混合物具有相應(yīng)的特征性度的肽段。這些肽段混合物具有相應(yīng)的特征性 ，因此，將，因此，將該特征性稱為該特征性稱為肽段質(zhì)量圖譜肽

39、段質(zhì)量圖譜 ，又稱為，又稱為肽質(zhì)量指紋譜，肽質(zhì)量指紋譜，或或質(zhì)質(zhì)量肽譜圖。量肽譜圖。不同蛋白具有不同肽質(zhì)量指紋譜。不同蛋白具有不同肽質(zhì)量指紋譜。PMF常用測定方法：常用測定方法：質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)肽質(zhì)量指紋圖譜（肽質(zhì)量指紋圖譜（peptide mass fingerprinting，PMF）l質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子的質(zhì)量、荷質(zhì)比差異來樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子的質(zhì)量、荷質(zhì)比差異來確定相對分子質(zhì)量，即測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量來判別蛋確定相對分子質(zhì)量，即測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量來判別蛋白質(zhì)種類的技術(shù)。白質(zhì)種類的技術(shù)。質(zhì)譜儀（質(zhì)譜儀（Mass spectrometer）：）：

40、5部分部分進樣裝置、離子化源、質(zhì)進樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)量分析器、離子檢測器、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，其中離子化源和質(zhì)量分析器是核心，其中離子化源和質(zhì)量分析器是核心部分。部分。離離子子化化器器分離器分離器聚焦器聚焦器噴嘴噴嘴質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器離子檢測器離子檢測器離子化源離子化源進樣裝置進樣裝置數(shù)據(jù)分析器數(shù)據(jù)分析器燈絲燈絲加熱器加熱器防護罩防護罩電子電子狹縫狹縫 電子束電子束正極正極 電離區(qū)電離區(qū) 推斥推斥 溢出分子溢出分子 氣束氣束一次加速縫一次加速縫聚焦縫聚焦縫二次加速縫二次加速縫電離加速區(qū)電離加速區(qū)熱電偶熱電偶分析通道分析通道進入離子進入離子偏離離子偏離離子放大通道

41、放大通道收集器收集器窄縫窄縫收集器窄縫收集器窄縫至前置放大器至前置放大器l離子化源類別離子化源類別（1）電噴霧離子化（）電噴霧離子化（ESI）（2）基質(zhì)輔助的激光解吸離子化（）基質(zhì)輔助的激光解吸離子化（MAIDI)（3）化學(xué)電離）化學(xué)電離（4）快離子轟擊電離等）快離子轟擊電離等l質(zhì)量分析器差異質(zhì)量分析器差異（1）單聚焦質(zhì)譜）單聚焦質(zhì)譜（2）雙聚焦質(zhì)譜）雙聚焦質(zhì)譜（3）飛行時間質(zhì)譜（）飛行時間質(zhì)譜（TOF)（4）四極桿質(zhì)譜（直流電極）四極桿質(zhì)譜（直流電極+射頻電極，共射頻電極，共4組）。組）。l離子化源與質(zhì)量分析器組合離子化源與質(zhì)量分析器組合（1）ESI-四極桿質(zhì)譜四極桿質(zhì)譜（2）離子阱質(zhì)譜（環(huán)

42、形電極）離子阱質(zhì)譜（環(huán)形電極+雙曲面形端蓋電極）雙曲面形端蓋電極）（3）MAIDL-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光離子化（基質(zhì)輔助激光離子化飛行時間）。飛行時間）。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析：蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析：（1）ESI（2）MAIDI采用采用“軟電離軟電離”，保留整個蛋白分子的，保留整個蛋白分子的完整性。完整性。質(zhì)譜儀分類質(zhì)譜儀分類電離電離分子電離分子電離分子電離分子電離額外片段額外片段抽真空抽真空放大放大l電噴霧質(zhì)譜電噴霧質(zhì)譜原理：原理：在毛細管出口處施加在毛細管出口處施加高電壓高電壓，當(dāng)分當(dāng)分析物從毛細管析物從毛細管霧化噴出霧化噴出時，其表面帶電并隨時，其表面帶電并隨溶劑蒸發(fā)。此時霧化分析物處于不斷增大

43、的電溶劑蒸發(fā)。此時霧化分析物處于不斷增大的電荷強度之下，最后崩解為帶電離子，并以荷強度之下，最后崩解為帶電離子，并以氣氣相狀態(tài)相狀態(tài)進入質(zhì)量分析器，從而可以測定分析進入質(zhì)量分析器，從而可以測定分析物的物的荷質(zhì)比荷質(zhì)比，進而確定分析物的相對分子量。，進而確定分析物的相對分子量。適用：適用：分子量數(shù)萬道爾頓的蛋白質(zhì)分子量數(shù)萬道爾頓的蛋白質(zhì)準確度：準確度：萬分之一萬分之一主要優(yōu)點：主要優(yōu)點：可與可與HPLC儀（高效液相儀（高效液相色譜儀）實現(xiàn)液質(zhì)聯(lián)用，可使蛋白色譜儀）實現(xiàn)液質(zhì)聯(lián)用，可使蛋白質(zhì)的酶解產(chǎn)物同時得到質(zhì)的酶解產(chǎn)物同時得到HPLC肽譜和肽譜和一張精確的質(zhì)譜。一張精確的質(zhì)譜。l基質(zhì)輔助激光解析電

44、離飛行時間質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS ）原理原理： 通過通過激光照射共結(jié)晶薄膜激光照射共結(jié)晶薄膜，使其上的使其上的基質(zhì)吸能激發(fā)基質(zhì)吸能激發(fā)。隨即，。隨即，膜上膜上生物分子接受生物分子接受基質(zhì)基質(zhì)激發(fā)激發(fā)出的出的質(zhì)子而電離質(zhì)子而電離成帶電分子。帶電分子在電場作成帶電分子。帶電分子在電場作用下加速飛過飛行管道，此時，檢測器檢測飛行時間，根據(jù)用下加速飛過飛行管道，此時，檢測器檢測飛行時間，根據(jù)質(zhì)荷比（質(zhì)荷比（M/Z）與飛行）與飛行時間正比時間正比的關(guān)系，計算得到生物分子的相對分子量。的關(guān)系，計算得到生物分子的相對分子量。適用：適用： 30萬道爾頓蛋白質(zhì)萬道爾頓蛋白

45、質(zhì)準確度：準確度：十萬分之一十萬分之一要點：要點：用樣品量極微（用樣品量極微（1-2pmol），非常快速（數(shù)分鐘完成分析）。可與羧肽酶或氨肽酶結(jié)合），非?？焖伲〝?shù)分鐘完成分析）。可與羧肽酶或氨肽酶結(jié)合進行蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)C端與端與N端的順序測定，研究蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)。端的順序測定，研究蛋白質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)。由一對由一對環(huán)形電極環(huán)形電極（ring electrod）和）和兩個呈雙曲面形的端蓋電極兩個呈雙曲面形的端蓋電極（end cap electrode）組成。在環(huán)形電極上加射頻電壓或再加直流電壓，上下兩個端蓋電極接地。逐組成。在環(huán)形電極上加射頻電壓或再加直流電壓，上下兩個端蓋電極接地。逐漸增大射頻電壓

46、的最高值，離子進入不穩(wěn)定區(qū)，由端蓋極上的小孔排出。因此，當(dāng)射頻電壓的最高漸增大射頻電壓的最高值，離子進入不穩(wěn)定區(qū)，由端蓋極上的小孔排出。因此，當(dāng)射頻電壓的最高值逐漸增高時，質(zhì)荷比從小到大的離子逐次排除并被記錄而獲得質(zhì)譜圖。離子阱質(zhì)譜可以很方便地值逐漸增高時，質(zhì)荷比從小到大的離子逐次排除并被記錄而獲得質(zhì)譜圖。離子阱質(zhì)譜可以很方便地進行多級質(zhì)譜分析，對于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定非常有用。進行多級質(zhì)譜分析，對于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的鑒定非常有用。l離子阱質(zhì)譜（離子阱質(zhì)譜（Ion Trap）l四極桿質(zhì)譜四極桿質(zhì)譜(Quadrupole)由四根帶有由四根帶有直流電壓（直流電壓（DC）和和疊加的射頻電壓（疊加的射頻電壓（RF）

47、的準確平行桿構(gòu)的準確平行桿構(gòu)成，相對的一對電極是等電位的，兩對電極之間電位相反。當(dāng)一組質(zhì)荷比不同的離子進入由成，相對的一對電極是等電位的，兩對電極之間電位相反。當(dāng)一組質(zhì)荷比不同的離子進入由DC和和RF組成的電場時，只有滿足特定條件的離子作穩(wěn)定振蕩通過四極桿，到達監(jiān)測器而被檢測。通過掃組成的電場時，只有滿足特定條件的離子作穩(wěn)定振蕩通過四極桿，到達監(jiān)測器而被檢測。通過掃描描RF場可以獲得質(zhì)譜圖。四極桿成本低，價格便宜，雖然目前日常分析的質(zhì)荷比的范圍只能達到場可以獲得質(zhì)譜圖。四極桿成本低，價格便宜，雖然目前日常分析的質(zhì)荷比的范圍只能達到3000，但由于分析器內(nèi)部可容許較高壓力，很適合在大氣壓條件下產(chǎn)

48、生離子的，但由于分析器內(nèi)部可容許較高壓力，很適合在大氣壓條件下產(chǎn)生離子的ESI離子化方式，并且，離子化方式，并且，ESI電離最突出特點是產(chǎn)生多電荷，蛋白質(zhì)和其他生物分子電噴霧電離所產(chǎn)生的電荷分布一般在電離最突出特點是產(chǎn)生多電荷，蛋白質(zhì)和其他生物分子電噴霧電離所產(chǎn)生的電荷分布一般在3000以下，所以四極桿廣泛地與以下，所以四極桿廣泛地與ESI聯(lián)用。另外，三重四極桿由于可以做聯(lián)用。另外，三重四極桿由于可以做多級質(zhì)譜多級質(zhì)譜，定量也方便，使用極，定量也方便，使用極為廣泛。為廣泛。 l串聯(lián)質(zhì)譜串聯(lián)質(zhì)譜質(zhì)譜質(zhì)譜-質(zhì)譜法，多級質(zhì)譜法，二維質(zhì)譜法和序貫質(zhì)譜法質(zhì)譜法，多級質(zhì)譜法，二維質(zhì)譜法和序貫質(zhì)譜法磁分析器

49、磁分析器-靜電分析器靜電分析器-磁分析器磁分析器 靜電分析器靜電分析器-磁分析器磁分析器-靜電分析器靜電分析器 三重四極濾質(zhì)器質(zhì)譜儀三重四極濾質(zhì)器質(zhì)譜儀 混合式串聯(lián)質(zhì)譜儀混合式串聯(lián)質(zhì)譜儀 質(zhì)譜技術(shù)的作用質(zhì)譜技術(shù)的作用蛋白質(zhì)序列分析：蛋白質(zhì)序列分析：通過串聯(lián)質(zhì)譜實現(xiàn)，得到通過串聯(lián)質(zhì)譜實現(xiàn)，得到N端和端和C端碎片離子系列，綜合分析就可得出肽片斷端碎片離子系列，綜合分析就可得出肽片斷的氨基酸序列。的氨基酸序列。研究蛋白質(zhì)的修飾：研究蛋白質(zhì)的修飾：特征離子檢測特征離子檢測: 確定磷酸化肽或和蛋白酶解、糖苷酶酶解相結(jié)合確定糖確定磷酸化肽或和蛋白酶解、糖苷酶酶解相結(jié)合確定糖蛋白；蛋白；串聯(lián)質(zhì)譜檢測：串聯(lián)質(zhì)

50、譜檢測：確定磷酸化、糖基化位點，并分析糖鏈的組成、結(jié)構(gòu)及確定磷酸化、糖基化位點，并分析糖鏈的組成、結(jié)構(gòu)及分支情況。分支情況。三維結(jié)構(gòu)分析和生物分子互作研究三維結(jié)構(gòu)分析和生物分子互作研究Lentz et al. Virology Journal 2019 3:13E1胰蛋白酶消化的磷酸蛋白胰蛋白酶消化的磷酸蛋白MALDI- QTof肽質(zhì)量指紋圖譜肽質(zhì)量指紋圖譜 a：磷酸化位點：磷酸化位點LDLIDEEEDpSEEDGDSMRb：磷酸化位點：磷酸化位點VLpTPLQVQGEGEGR2.2.2 蛋白質(zhì)序列鑒定蛋白質(zhì)序列鑒定測序技術(shù)測序技術(shù)l串聯(lián)質(zhì)譜測序技術(shù)串聯(lián)質(zhì)譜測序技術(shù)lN端測序法：端測序法： E

51、dman降解法、丹磺酰氯法，降解法、丹磺酰氯法， 二硝基苯氟法、毛細管電泳技術(shù)）二硝基苯氟法、毛細管電泳技術(shù)）lC端測序法：異硫氰酸法端測序法：異硫氰酸法（利用（利用C端羧基水解（羧基肽酶）來進行測序端羧基水解（羧基肽酶）來進行測序 ，但由于，但由于C端羧基端羧基化學(xué)性質(zhì)不活潑，導(dǎo)致效率很低（化學(xué)性質(zhì)不活潑，導(dǎo)致效率很低（ 6-8個殘基）個殘基）原理：原理：使用異硫氰酸苯酯（使用異硫氰酸苯酯（PTC)與肽肽鏈氨基酸反應(yīng)產(chǎn)與肽肽鏈氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生生PTC-肽，在強酸作用下，末端肽，在強酸作用下，末端aa掉下來，形成環(huán)化掉下來，形成環(huán)化PTC-aa。而失去一個。而失去一個aa的肽又可以再次與的肽又可

52、以再次與PTC反應(yīng)，這反應(yīng)，這樣循環(huán)測序。樣循環(huán)測序。苯乙內(nèi)酰硫氨基酸（苯乙內(nèi)酰硫氨基酸（PTH-aa ）環(huán)化環(huán)化苯氨基硫甲酰肽（苯氨基硫甲酰肽（PTC-肽）肽）強酸強酸異硫氰酸苯酯異硫氰酸苯酯（PTC）肽鏈肽鏈失去原失去原N-端端毛細管電泳技術(shù)：毛細管電泳技術(shù)：蛋白質(zhì)微量蛋白質(zhì)微量N端順序測定。端順序測定。原理：原理：是根據(jù)在電場作用下離子遷移的速度不同而對組分進是根據(jù)在電場作用下離子遷移的速度不同而對組分進行分離和分析。行分離和分析。特點：特點：靈敏度比靈敏度比HPLC高兩個數(shù)量級。樣品需量少（高兩個數(shù)量級。樣品需量少（10fmol）的水平檢測氨基酸。的水平檢測氨基酸。丹磺酰氯法丹磺酰氯法

53、:強熒光劑，能專一結(jié)合肽鏈強熒光劑，能專一結(jié)合肽鏈-氨基生成丹磺酰氨基生成丹磺酰-肽，隨后水解生成丹磺酰肽，隨后水解生成丹磺酰-氨基酸氨基酸 ，然后電泳可鑒定，然后電泳可鑒定N端端氨基酸。氨基酸。 二硝基苯氟法：二硝基苯氟法：陽離子陽離子陰離子陰離子中性離子中性離子質(zhì)譜儀質(zhì)譜儀 毛細管電泳儀毛細管電泳儀 Edman 降解測序儀降解測序儀 C端測序儀端測序儀 問題解決：問題解決：新的偶聯(lián)和裂解試劑；新的偶聯(lián)和裂解試劑；HPLC（液相色譜）（液相色譜）2.2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析l 溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)：（1）NMR（2）圓二色譜法）圓二色譜法（3）激光拉曼光譜法）激光拉

54、曼光譜法（3）紫外差光譜法）紫外差光譜法（4）氫同位素交換法。）氫同位素交換法。l 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)：（1）X-射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）（2）多維核磁共振波譜分析）多維核磁共振波譜分析（3）電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）l 生物信息學(xué)預(yù)測：生物信息學(xué)預(yù)測：（1）分子力學(xué)、分子動力學(xué)，理論計算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。）分子力學(xué)、分子動力學(xué)，理論計算蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。（2）通過已知空間結(jié)構(gòu)推測未知空間結(jié)構(gòu)。）通過已知空間結(jié)構(gòu)推測未知空間結(jié)構(gòu)。2.3.蛋白質(zhì)互作蛋白質(zhì)互作l蛋白質(zhì)間互作鑒定：蛋白質(zhì)間互作

55、鑒定：（1）蛋白質(zhì)亞基的聚合：）蛋白質(zhì)亞基的聚合：線性、環(huán)狀、螺旋、球狀、交叉聚合線性、環(huán)狀、螺旋、球狀、交叉聚合（2）分子識別：）分子識別：抗原與抗體、配體與受體、酶與底物抗原與抗體、配體與受體、酶與底物（3）分子的自我裝配：）分子的自我裝配：核糖體、細菌鞭毛、病毒的自動裝配核糖體、細菌鞭毛、病毒的自動裝配（4）多酶復(fù)合體：）多酶復(fù)合體：丙酮酸脫氫酶復(fù)合體包括丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；负投淞蛐了崦摎涿?。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體包括丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙?；负投淞蛐了崦摎涿?。l蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-核酸互作鑒定核酸互作鑒定:（1）轉(zhuǎn)錄起始）轉(zhuǎn)錄起始/調(diào)控調(diào)控（2）染色體的形成）染色體的形

56、成（1）氫鍵：）氫鍵：肽鍵之間，主側(cè)、側(cè)側(cè)鏈之間肽鍵之間，主側(cè)、側(cè)側(cè)鏈之間（2）范德華力：）范德華力：取向力、誘導(dǎo)力、色散力取向力、誘導(dǎo)力、色散力（3）疏水鍵：）疏水鍵：非極性基團為了避開水相二群集在一起的作用力。非極性基團為了避開水相二群集在一起的作用力。（4）離子鍵（鹽鍵）：）離子鍵（鹽鍵）：正負離子之間的靜電引力所形成的化學(xué)鍵。正負離子之間的靜電引力所形成的化學(xué)鍵。作用力作用力蛋白質(zhì)相互作用的研究方法蛋白質(zhì)相互作用的研究方法l體外：體外：（1）肽蛋白質(zhì)親和層析）肽蛋白質(zhì)親和層析（2）親和印跡）親和印跡（3）免疫沉淀）免疫沉淀（4）交聯(lián)等）交聯(lián)等l體內(nèi)：體內(nèi)：（1）酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交

57、系統(tǒng)（2）噬菌體展示技術(shù)）噬菌體展示技術(shù)（3）生物傳感芯片質(zhì)譜）生物傳感芯片質(zhì)譜（4）蛋白質(zhì)定點誘變）蛋白質(zhì)定點誘變l酵母雙雜交系統(tǒng)（酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast Two-hybrid System）理論基礎(chǔ)：理論基礎(chǔ)：真核生物對轉(zhuǎn)錄起始過程的調(diào)控。真核生物對轉(zhuǎn)錄起始過程的調(diào)控。 基因轉(zhuǎn)錄原基因轉(zhuǎn)錄原則上是關(guān)閉的（阻遏蛋白），只有當(dāng)需要的時候才開啟。則上是關(guān)閉的（阻遏蛋白），只有當(dāng)需要的時候才開啟。而開啟需要反式作用因子的參與。而開啟需要反式作用因子的參與。 負調(diào)控：負調(diào)控：阻遏蛋白阻遏蛋白(Repressor Protein)結(jié)合在受調(diào)控的基因上時，基因不表結(jié)合在受調(diào)控的基因上時，基因不表達。

58、達。正調(diào)控：正調(diào)控：去除靶基因上的阻遏蛋白，使去除靶基因上的阻遏蛋白，使RNA聚合酶識別基因啟動子，使基聚合酶識別基因啟動子，使基因得以表達。發(fā)揮這種功能的蛋白是反式作用因子因得以表達。發(fā)揮這種功能的蛋白是反式作用因子轉(zhuǎn)錄激活因子。轉(zhuǎn)錄激活因子。轉(zhuǎn)錄因子：轉(zhuǎn)錄因子：去除基因啟動子區(qū)域的阻遏蛋白，具有組件式結(jié)構(gòu)，即具有去除基因啟動子區(qū)域的阻遏蛋白，具有組件式結(jié)構(gòu)，即具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA Binding Domain, DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)，引導(dǎo)，引導(dǎo)RNA聚合酶識別啟動子區(qū)域序列，開啟基因的轉(zhuǎn)錄表達。聚合酶識別啟動

59、子區(qū)域序列，開啟基因的轉(zhuǎn)錄表達。雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)：雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)：不同類型的轉(zhuǎn)錄激活因子其不同類型的轉(zhuǎn)錄激活因子其DB與與AD雜合形成正常蛋雜合形成正常蛋白仍具有正調(diào)控功能。白仍具有正調(diào)控功能。XADActivating domainBDBinding domainRNA聚合酶聚合酶啟動子啟動子AD和和RNA聚合酶互作聚合酶互作BD和啟動和啟動子互作子互作BDAD啟動子啟動子Y待研究的蛋白待研究的蛋白YYX待研究的蛋白待研究的蛋白XBDAD酵母雙酵母雙雜合系雜合系統(tǒng)原理統(tǒng)原理模式圖模式圖Fields等構(gòu)建的酵母雙雜交系統(tǒng)等構(gòu)建的酵母雙雜交系統(tǒng)1、與調(diào)控與調(diào)控SUC2基因有關(guān)的兩個蛋白質(zhì)基因有關(guān)的

60、兩個蛋白質(zhì)Snf1和和Snf2, 將前者與將前者與Gal4蛋白的蛋白的DB結(jié)構(gòu)域融合結(jié)構(gòu)域融合, 另外一個與另外一個與Gal4蛋白的蛋白的AD結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。酸性區(qū)域融合。 (Snf1-DB，Snf2-AD) Snf1-DB: 誘餌蛋白誘餌蛋白 Snf2-AD：捕獲蛋白捕獲蛋白/靶蛋白靶蛋白2、將含有這兩種融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到將含有這兩種融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GAL4基因和基因和GAL80基基因被缺失因被缺失（排除細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響）（排除細胞內(nèi)源調(diào)控因子的影響）的酵母細胞（的酵母細胞（報道株報道株）中。）中。3、結(jié)果：只有同時轉(zhuǎn)化了結(jié)果：只有同時轉(zhuǎn)化了Snf1和和Snf2融合表達載體