OPRM基因測序報告維真生物

1、維真慢病毒系統(tǒng)產(chǎn)品手冊聲明：1、Vigene生物科技公司的產(chǎn)品僅限用于研究，不可用于包括人類或體外診斷和治療在內(nèi)的其他用途。2、Vigene生物科技公司的產(chǎn)品，不得修改和轉(zhuǎn)售、轉(zhuǎn)贈給任何第三方，未經(jīng)Vigene生物科學(xué)公司的書面批準(zhǔn)，不得將產(chǎn)品用于向其他第三方提供服務(wù)或用于制造商品化產(chǎn)品。產(chǎn)品有限責(zé)任擔(dān)保Vigene生物保證您收到的產(chǎn)品符合產(chǎn)品目錄上的規(guī)格。本擔(dān)保規(guī)定了Vigene更換產(chǎn)品的責(zé)任。Vigene生物不提供其他任何形式的對于產(chǎn)品商業(yè)或健康用途的保證。Vigene生物不對任何由于使用或不正確使用本公司產(chǎn)品造成的直接、間接的、衍生的或偶然的損害所產(chǎn)生的后果負(fù)責(zé)。產(chǎn)品儲存收到產(chǎn)品后，請第

2、一時間在BL2生物安全柜中根據(jù)實驗所需量將病毒進(jìn)行分裝。分裝病毒時請將病毒始終放置在冰上。分裝的病毒可在4 保存3天，其余病毒請于-80 冰箱凍存。請避免反復(fù)凍融，否則會降低病毒滴度！一、產(chǎn)品介紹Vigene慢病毒載體可具有各種標(biāo)簽和熒光標(biāo)記，其中大部分都具有與Vigene率先推出的pEnter穿梭載體相同的MCS多克隆位點及篩選標(biāo)記。Myc、Flag、His、HA等融合標(biāo)簽方便改造，可依據(jù)您的需要添加在N端或C端。與質(zhì)粒載體相比，慢病毒載體可以產(chǎn)生更加穩(wěn)定的體外轉(zhuǎn)染，Vigene提供的慢病毒載體如下：用途慢病毒載體        &

3、#160;        過表達(dá)pLent-GFP-Puro-CMVpLent-RFP-Puro-CMVpLent-Puro-CMVpLent-GFP-Blasticidin-CMVpLent-RFP-Blasticidin-CMVpLent-Blasticidin-CMV（EF1a啟動熒光報告基因/篩選標(biāo)記；CMV啟動插入基因，C端融合Myc-Flag標(biāo)簽）pLent-EF1a-FH-CMV-GFP-P2A-Puro（EF1a啟動插入基因，C端融合Flag-His標(biāo)簽；CMV啟動熒光報告基因和篩選標(biāo)記）  干擾pLent-U6-GF

4、P-PuropLent-U6-RFP-PuropLent-H1-GFP-PuropLent-H1-RFP-PuropLent-U6-Puro 其他pLent-MIR-GFP-PuropLent-MIR-RFP-Puro（microRNA雙標(biāo)載體，可構(gòu)建microRNA過表達(dá)和sponge抑制克?。﹑Lent-EF1a-Puro-CMV-Luciferase注：更多慢病毒載體信息可登陸網(wǎng)站查看或咨詢Vigene技術(shù)支持。慢病毒載體圖譜：二、操作步驟（一）慢病毒安全操作規(guī)范Vigene慢病毒載體是第三代慢病毒載體，其3' LTR的增強子功能發(fā)生缺失，形成了自滅活（sefl-ina

5、ctivating，SIN） 的3 LTR, 5LTR中的U3區(qū)替換成CMV，是最安全的慢病毒載體。但操作者在實驗中仍需保持高度警惕，嚴(yán)格按照以下操作規(guī)范進(jìn)行：       1使用慢病毒載體前請向您所在機構(gòu)的生物安全部門征得許可和指令。2.   請在BL2生物安全二級生物安全柜中操作病毒粒子。 3.   請務(wù)必穿著實驗服，佩戴一次性口罩和手套。 4.   小心操作，避免產(chǎn)生氣霧、飛濺或灑落。5.  被病毒污染的超凈工作臺，請立即用加入1% SDS的70%乙醇溶液擦拭

6、干凈；請務(wù)必將接觸病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液使用新配制的10漂白粉、84消毒液或0.6%次氯酸鈉溶液浸泡1小時以上再丟棄。6.  裝盛慢病毒的實驗用品需單獨放置及培養(yǎng)，并加以標(biāo)示。7. 用顯微鏡觀察細(xì)胞感染情況時，請先擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，用70%乙醇擦拭培養(yǎng)瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實驗臺。8. 離心病毒時，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進(jìn)行離心，請盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機。9.  實驗完畢脫掉手套后，請立即用肥皂和水清洗雙手。10. 對共用實驗室的人員需進(jìn)行慢病毒安全培訓(xùn)或提示。（二）慢病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實

7、驗不同的細(xì)胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議在正式實驗前，在目的細(xì)胞中進(jìn)行預(yù)實驗摸索最佳MOI值（使用Vigene慢病毒在HepG2、A549和Hela細(xì)胞中進(jìn)行MOI摸索獲得的參考值，詳見附錄7）。為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進(jìn)行預(yù)實驗。操作步驟如下：1. 第一天  細(xì)胞的準(zhǔn)備將目的細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞融合率為50%為最佳。為保證細(xì)胞生長良好，請保證細(xì)胞貼壁過夜。2. 第二天  病毒的稀釋取10L慢病毒原液加入90L培養(yǎng)液中做1:100稀釋（10-2），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7?？筛鶕?jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。3. 第二天  感染目的細(xì)

8、胞取出提前準(zhǔn)備好的96孔板，用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)液，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對照組。4. 第二至十天  觀察熒光或檢測慢病毒對細(xì)胞的感染較慢，請在感染細(xì)胞后48、72、96、120小時分別觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況（如果您選擇的產(chǎn)品不帶有熒光標(biāo)簽，請在48、72、96、120小時分別收獲細(xì)胞并通過Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達(dá)）。注意事項：由于不同細(xì)胞對慢病毒感染過程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，請于12-24小時后觀察細(xì)胞狀態(tài)以確認(rèn)加入的病毒量是否合適。（三）慢病毒滴度測定      

9、0; Vigene慢病毒單位為TU/mL, 即每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。如：病毒滴度為>1×108 TU/mL 即每毫升病毒液中至少含有1×108個具有生物活性的慢病毒顆粒。慢病毒的病毒滴度（TU/mL）可根據(jù)熒光蛋白在HEK293細(xì)胞中表達(dá)量確定，具體操作步驟如下：1.     第一天   細(xì)胞的準(zhǔn)備在96孔板中的每個孔中接種1-4×104個 HEK293細(xì)胞。      2第二天   病毒的稀釋和感染。 

10、;                                                  

11、;                          在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋。稀釋方法為：每種病毒準(zhǔn)備8個1.5mL Eppendorf管，每管加入297L完全培養(yǎng)液，向第一個管中加入33µL病毒原液，混勻后，吸取30µL加入第二個管混勻。依此類推，做8個稀釋度（1010-6）。棄去96孔板中原有的培

12、養(yǎng)液，每個稀釋度重復(fù)3個孔，每孔加入含稀釋好的病毒液100L。并做好標(biāo)記。實驗預(yù)覽如圖：1.     第五天  熒光計數(shù)和滴度計算用熒光顯微鏡對熒光陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。數(shù)出最后兩個能觀察到熒光的孔內(nèi)的熒光細(xì)胞數(shù)，計算3個重復(fù)孔內(nèi)的總數(shù)之和并計算出平均數(shù)，假設(shè)為A（倒數(shù)第二個能見熒光孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）和B（倒數(shù)第一個能見熒光孔的熒光細(xì)胞平均數(shù)）。慢病毒病毒滴度計算公式：病毒滴度 (TU/mL) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（L）（四）慢病毒感染目的細(xì)胞進(jìn)行慢病毒感染實驗時可使用完全培養(yǎng)液（培養(yǎng)目的細(xì)胞用）稀釋

13、。培養(yǎng)液中的血清、雙抗或其他營養(yǎng)因子不會影響慢病毒的感染效率。以24 孔培養(yǎng)板為例，進(jìn)行HEK293細(xì)胞的感染實驗操作步驟如下：注意事項：實驗前請按照不同的MOI 設(shè)置不同的感染孔，并根據(jù)MOI 和細(xì)胞數(shù)量計算所需要的病毒量。1.   第一天  細(xì)胞的準(zhǔn)備在24孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種3-5×104個HEK 293細(xì)胞，鋪板時細(xì)胞的融合率為50%左右，每孔培養(yǎng)液體積為300L，進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的融合率約為70%左右。2.  第二天  病毒的準(zhǔn)備根據(jù)實驗的實際情況和MOI 值，用培養(yǎng)液準(zhǔn)確稀釋慢病毒原液。注

14、意事項：可使用PBS緩沖液或無血清培養(yǎng)液稀釋病毒原液。3.  第二天  感染目的細(xì)胞在目的細(xì)胞和對照細(xì)胞中分別加入計算好的病毒液， 混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37 、5% CO2）孵育過夜。注意事項：1）感染前細(xì)胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大，請務(wù)必保證加入病毒前，細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)。2）若慢病毒對目的細(xì)胞的感染效率較低，可通過提高M(jìn)OI  值提高病毒的感染效率，也可在培養(yǎng)液中加入助感染試劑ADV-HR（詳見附錄1、附錄4、附錄5）來提高病毒的感染效率。4. 第三天  更換培養(yǎng)液病毒感染細(xì)胞24小時后，更換培養(yǎng)液。注意事項：換液具

15、體時間需視細(xì)胞狀態(tài)而定。如果慢病毒對細(xì)胞有明顯毒性作用，影響細(xì)胞生長狀態(tài)，最短可于加病毒4小時后更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。5. 第六天  感染效率檢測在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計算慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如選擇的慢病毒載體不帶有熒光標(biāo)記，可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達(dá)來評估感染效率。注意事項：1）慢病毒表達(dá)較慢，熒光表達(dá)所需時間較長，建議感染96小時后觀察熒光的表達(dá)。2）感染后的細(xì)胞可以連續(xù)培養(yǎng)一周，通過觀察熒光表達(dá)的時間和強度來確定慢病毒對目的細(xì)胞的感染情況。    3）感染期間，請根據(jù)細(xì)胞生長的情況及時換液，以保證細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。三、

16、附錄附錄1.   常見問題解答1.    慢病毒感染后，細(xì)胞狀態(tài)很差，甚至出現(xiàn)死亡，為什么？慢病毒會對細(xì)胞造成一定的毒性，不同細(xì)胞對毒性的耐受力不同。建議您降低感染時使用的MOI值，即可在細(xì)胞準(zhǔn)備時增加鋪板細(xì)胞的融合率（可提高至70%）或/和降低感染時加入的病毒量。此外，還可選擇在感染4小時后換液，用新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)觀察。2.    怎樣提高慢病毒的感染效率？細(xì)胞良好的生長狀態(tài)和感染時適合的MOI值是達(dá)到高感染效率的保證。一般可以通過提高感染時的MOI值來提高病毒的感染效率，必要時可在感

17、染時加入助感染試劑ADV-HR來提高慢病毒的感染效率。3.    助感染試劑ADV-HR的使用濃度和使用方法是什么？助感染試劑ADV-HR能夠顯著提高慢病毒的感染效率，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴效應(yīng)（詳見附錄4）。但較高濃度的ADV-HR具有細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞狀態(tài)和感染效率。我們建議您務(wù)必于目的細(xì)胞中進(jìn)行ADV-HR濃度梯度預(yù)實驗。我們在HEK293中的實驗表明（詳見附錄5），當(dāng)ADV-HR使用濃度小于等于1.0×10-2mg/mL時，細(xì)胞狀態(tài)良好。此外，對于較難感染的細(xì)胞系（如CNE2）建議使用“孵育法”，即將助感染試劑、慢病毒和一定數(shù)量的細(xì)胞懸液

18、加至1.5mL Eppendorf管中，輕輕混勻，置于37培養(yǎng)箱中孵育0.5至1小時后轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；對于較易感染的細(xì)胞系（如HepG2）建議使用“直接加入法”，即在感染時，直接將助感染試劑、慢病毒滴加至培養(yǎng)皿中。建議您針對目的細(xì)胞的具體情況，選擇合適的感染方法。      4. 慢病毒載體可插入多大的ORF片段？  一般情況下，慢病毒載體可容納8 kb插入片段。然而，插入的ORF基因大于4 kb時會大大降低病毒的包裝效率，進(jìn)而影響病毒滴度甚至基因表達(dá)。附錄2.   Vigene慢病毒感染HEK293細(xì)

19、胞案例109TU/mLMOI10感染后48小時拍照附錄3.   Vigene慢病毒滴度測定案例3.046×109 VP/mL3.20×108TU/mL感染后72小時拍照附錄4.  助感染試劑ADV-HR在Vigene慢病毒感染中的作用慢病毒滴度：109VP/mL   感染后48及110小時拍照附錄5.  摸索助感染試劑ADV-HR的使用極值實驗實驗規(guī)模：96孔板(定容至100L)ADV-HR濃度：1mg/mL說明：1 ADV-HR終濃度在0至1.0×10-2mg/mL之間對細(xì)胞狀態(tài)無影響；      1.