第五章 間接凝集反應技術

1、第五章間接凝集反應技術(Indirect agglutination reaction technique)一、 概述（一）原理可溶性抗原（或抗體）吸附于免疫學反應無關的顆粒（稱為載體）表面上，當這些致敏的顆粒與相應的抗體（或抗原）相遇時，就會產生特異性的結合，在電解質參與下，這些顆粒就會發(fā)生凝集現(xiàn)象。這種借助于載體的抗原抗體凝集現(xiàn)象就叫做間接凝集反應。載體的存在使反應的敏感性得以大大提高。間接凝集反應的優(yōu)點為：敏感性強：間接凝集反應是最敏感性的血清學反應方法之一，可以檢測到微量的抗體和抗原；快速： 一般1h2h即可判定結果，若在玻板上進行，則只需幾分鐘；特異性強；使用方便、簡單。（二）載體具

2、有吸附抗原（或抗體）的載體很多，如聚苯乙烯乳膠、白陶土、活性炭、人和多種動物的紅血球、某些細菌等。良好載體有如下幾點基本要求：在生理鹽水或緩沖液無自凝傾向；大小均勻；比重與介質相似，短時間內不能沉淀；無化學或血清學活性；吸附抗原（或抗體）后，不影響其活性。目前應用最廣的是人的O型紅血球和綿羊紅血球。而后者應用更廣，因為其來源方便。另外綿羊紅血球的表面有大量的（約1 000個以上）糖蛋白受體，極易吸附某些抗原物質，吸附性能好，且大小均勻一致。（三）間接凝集的分類1根據載體的不同，可分為間接炭凝、間接乳膠凝集和間接血凝等。 2根據吸附物不同可分為間接凝集反應（吸附抗原）和反向間接凝集反應（吸附抗體

3、）。 3根據反應目的不同，又可分為間接凝集抑制反應和反向間接凝集抑制反應。 4根據用量和器材的不同又可分為試管法（全量法）、凹窩板法（半微量法）和反應板法（微量法）。二、 間接炭凝反應（一）原理 間接炭凝集反應簡稱炭凝。它是以炭粉微粒作為載體，將已知的抗體球蛋白吸附于這種載體上，形成炭粉抗體復合物，當炭血清與相應的抗原相遇時，二者發(fā)生特異性結合，形成肉眼可見的炭微粒凝集塊。目前炭凝反應已用于炭疽、鼠疫和馬副傷寒性流產等病的診斷。（二）材料與試劑 1炭粉 炭粉粒子最好大小在0.12mm0.15mm，目前市場上出售的炭粉均不合要求，必須過300目寸的標準篩以300rmin離心去沉淀，再以3 000

4、rmin離心去上清，收集沉淀物。 2高免血清 3待測標本 4滅活兔血清 5正常血清 6標準抗原 70.05mol/L pH7.2PBS液 81硼酸的PBS液（三）操作方法 1炭致敏 取濕炭粉0.25g（干粉0.10g），加入經5660滅活30min的稀釋高免血清3ml，充分搖勻，置37致敏30min，不時搖動，取出后用pH 7.2 PBS液洗滌3次。最后一次用含1硼酸和1兔血清的PBS液洗滌一次，離心去上清，再取此液3ml，混勻即可。同時以正常血清致敏的炭粒處理，以作對照。致敏血清（加1/萬硫柳汞防腐）于室溫或4冰箱中保存，一年內有效。 2取潔凈玻璃板一塊，以玻璃鉛筆劃成小格，加被檢標本0.1

5、0ml，再加免疫炭血清0.05ml，充分混勻，靜止1min5min，判定結果。同時設三個對照：免疫炭血清+標準抗原。正常炭血清+標準抗原。正常炭血清加待檢抗原。（四）結果判定在對照完全成立的情況下，判定本試驗結果：“”：炭粉全部凝集，液體完全清亮透明。“” ：炭粉大部分凝集，液體透明?！啊?：炭粉一半凝集，液體較透明?！啊?：炭粉微凝集，但與對照有差別，液體混濁。“” ：炭粉不凝集，液體不透明。炭凝以“”做為反應滴度的終點。三、 反向間接乳膠凝集反應（一）原理同炭凝，只是載體換為聚苯乙烯乳膠，它是一種由0.6m0.7m的顆粒所組成的膠體溶液，具有良好的吸附蛋白質的性能。間接乳膠凝集目前已用于鼠

6、疫菌、沙門氏菌、流感桿菌、腦膜炎雙球菌、葡萄球菌腸毒素等的診斷。（二）材料與試劑1聚苯乙烯乳膠2免疫血清3正常血清4標準抗原5待檢抗原60.02Mol/L pH8.2硼酸緩沖液硼砂 6.67g硼酸 8.04gH2O 加至 1 000ml 7生理鹽水（三）操作方法1乳膠液制備 取聚苯乙烯乳膠0.10ml，加滅菌蒸餾水0.40ml，再加pH8.2硼酸緩沖液2ml，混合后即為25倍稀釋的乳膠液。2乳膠致敏 在上述乳膠液中滴加稀釋的免疫血清0.20ml0.70ml，邊加邊搖，當出現(xiàn)肉眼可見的顆粒后，仍繼續(xù)加血清，直至顆粒消失，成為均勻的乳膠懸液為止。鏡下檢查應無自凝。使用時，應與一定稀釋度的相應抗原出

7、現(xiàn)陽性反應，與生理鹽水出現(xiàn)陰性反應為合格。加防腐劑后，于冰箱內保存。注意防止冰凍。同時以正常血清代替免疫血清進行乳膠致敏，以作對照。3取潔凈玻板一塊，用玻璃鉛筆劃成小格，滴加待檢樣品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳膠0.01ml，以牙簽或火柴桿混勻，在3min內判定結果。（四）結果判定 “”：全部乳膠凝集，成絮狀團塊，液體清亮。 “” ： 大部分乳膠凝集成較小的顆粒，液體清亮。 “” ： 半量乳膠凝集成細小顆粒，液體混濁。 “” ： 較少量的乳膠凝集成可見的細顆粒，液體混濁。 “” ： 全部乳膠仍為均勻液體，無顆粒。 以“”作為該反應滴度的終點。四、 間接紅血球凝集反應間接紅血球凝集反應（簡

8、稱間接血凝）是間接凝集反應中應用最廣的一種方法。（一）原理以紅血球為載體的間接凝集反應叫做間接血凝。將抗原吸附在紅血球上用以檢測微量抗體稱為正向間接血凝，以抗體吸附于紅血球上，檢測相應的抗原，稱為反向間接血凝。用抗原吸附紅血球，一般比較容易，但用免疫血清吸附紅血球，則困難得多，而且往往不易獲得良好的結果，因為免疫血清中的成分非常復雜。許多其他蛋白質和非抗體活性的免疫球蛋白占據紅血球的表面，而影響血球的特異性凝集。（二）材料與試劑1紅血球2反應板 分聚苯乙烯塑料板和有機玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔兩種規(guī)格。按孔型又可分為V和U型兩種，V型具有更典型的凝集模型，U型有時比V型

9、的血清效價高12孔。反應板不能煮沸消毒和浸泡于來蘇兒水中。消毒可用0.5甲醛溶液，1新潔爾滅及紫外線照射等。 3稀釋棒 由合金制成。棒頭有8條溝，吸液量為0.025ml，通過火焰，使表面氧化變粗易于吸取液體。它的作用是蘸取、轉移、混合液體。為了長期保持棒頭的氧化層，每使用20次左右，應過火焰一次。 4標準滴管 每滴0.025ml。 5微型振蕩器 6兔血清鹽水 作為穩(wěn)定劑，用于懸浮致敏紅血球以及稀釋供試血清。制法為：無菌采取兔血，收集血清，滅活后4保存。同時，取所需量加4倍量的2.5血球懸液，混勻，37水浴10min，以吸附異嗜性凝集素，離心后取上清；再以pH7.2PBS稀釋成1兔血清鹽水，冰箱

10、保存可供數(shù)日內之用。7抗原 盡可能使用高純度的抗原。8供試血清或其它含抗體材料 供試血清必須滅活，加9倍2.5的紅血球懸液，37水浴10min20min，進行吸收，然后離心，取上清，即為1:10的血清稀釋液。9醛化劑 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。10優(yōu)質鞣酸110.15Mol/L pH6.4PBS液，用于紅血球致敏。120.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀釋液。130.02牛血清白蛋白PBS液14生理鹽水（三）紅血球的處理 1新鮮紅血球 新鮮紅血球用阿氏液保存于4，可供3周內使用。采用新鮮紅血球做凝集反應，模型新鮮，典型，而且敏感性也比醛化紅血球高出12個滴度。但用新鮮紅血球致敏后，

11、保存時間短，而且不同動物個體和不同批次來源的紅血球均有差異，影響試驗結果和分析。為了克服這一缺點，目前多采用醛化紅血球或鞣化紅血球。2紅血球醛化極其優(yōu)點（1）醛化方法：常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。甲醛醛化過程：將紅血球用pH7.2PBS反復洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質；按18的比例取紅血球（壓積）和3甲醛液（用pH7.2PBS稀釋，預先冷卻至4），緩慢混合，加膠塞4作用24h，不時搖動；傾去上清液，再以12（VV）加入3638冷的（10）甲醛溶液，混勻，再放入424h；離心去上清，以生理鹽水反復洗滌4次。徹底清除甲醛液，最后以生理鹽水配成10懸液甲醛化紅血球，加1萬

12、硫柳汞防腐，4保存。戊二醛醛化過程：取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次；以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1戊二醛溶液，4保存?zhèn)溆茫粚?00ml 1冰冷的戊二醛液加入到10ml15ml紅血球中，邊加邊攪拌（也可置電磁攪拌器上）30min；離心去上清，以生理鹽水洗滌4次，最后以PBS液（或生理鹽水）配成10懸液，加1萬硫柳汞，4保存。丙酮醛甲醛雙醛化過程：取新鮮紅血球，洗滌4次，配成8的懸液；于紅血球懸液中加等量的3丙酮醛室溫電磁攪拌16h18h；洗滌5次，再配成8的懸液；于紅血球懸液中加等量的3甲醛，電磁攪拌16h18h；洗滌5次，最后以pH 7.2 PBS配成10的懸液，加1萬硫柳

13、汞防腐，4保存。（3）醛化紅血球的優(yōu)點：性質穩(wěn)定，不影響紅血球表面的吸附能力；重復性好，易標準化?？奢^長期保存，醛化后4保存，有效期可至1年，如凍干保存，有效期則更長。（4）影響醛化的因素：紅血球的潔凈程度：由于紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質，易引起自家凝集，所以一定要充分洗凈；紅血球的濃度：醛化時應盡量使紅血球稀釋度低一些，以減少紅血球的凝集和變形；醛化時的溫度與醛化紅血球的質量有很大關系，一般認為最好是37。但有人認為應于4進行醛化；醛化劑的濃度和醛化次數(shù)：醛化劑的濃度過大，易引起紅血球皺褶，濃度過低，又會增加溶血機會，所以一般以3醛化濃度為宜。家禽紅血球一般醛化12次即可，而哺乳動物紅

14、血球醛化2次比醛化1次要好，敏感性高，保存時間也長。不同的雙醛化，其抗原致敏作用有所不同，表51是各種雙醛化法的結果比較。表51 各種雙醛化紅細胞的結果比較雙 醛 化上海第六人民醫(yī)院首都醫(yī)院國外資料抗原滴度 抗原滴度脈沖min抗原滴度脈沖min丙酮醛甲醛戊二醛丙酮醛丙酮醛戊二醛217219215211510751182×1066×1066×106168421543750脈沖min是131I標記的特異性抗體結合到細胞上的指標，脈沖數(shù)越大，結合抗體量也越多。但是從表51中可以看出結合量同可測出的抗原滴度是不平行的。 適當?shù)恼袷幙墒谷┗瘎┡c紅血球充分接觸，并可排除凝塊形

15、成。但過分地振蕩，則易產生氣泡，引起紅血球變形。 3紅血球鞣化 多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易于吸附紅血球表面，所以一般醛化處理即可。但對于許多蛋白質抗原，由于不易吸附于紅血球表面，所以在醛化的基礎上，必須再以一定濃度的鞣酸進行處理，強化它對蛋白質的吸附能力。有人認為雙醛化后可不必進行鞣化。首都醫(yī)院做了“丙酮醛甲醛鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數(shù)意見認為醛化后仍需鞣化比較好。(1) 鞣化過程：將10醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次，最后以PBS配成2.50懸液；稱取優(yōu)質鞣酸20mg，以生理鹽水4ml配成1200的濃度，于37水浴，使之充

16、分溶解，然后再以pH7.2PBS稀釋成12 000的濃度。當天配制、當天用完；1份2.5紅血球懸液與1份12 000鞣酸液充分混合，37水浴10min，1 500rmin離心，去上清，用PBS液洗滌1次；以0.02牛血清白蛋白PBS液洗滌1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5鞣化紅血球。（2）影響鞣化的因素：鞣酸的質量：這是很重要的，所以必須采用優(yōu)質鞣酸。分析純的鞣酸呈面包屑狀，不呈面粉狀，有折光性；鞣酸的濃度：濃度過高，可以出現(xiàn)紅血球的凝集現(xiàn)象；濃度過低，達不到紅血球的活化作用。醛化過的紅血球所采用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以1：2 000為佳；鞣化時間：鞣化過程一般10mi

17、n15min即可完成。時間再長也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化時采用的pH對吸附抗原和血凝滴度影響不大，一般采用pH7.2的PBS液。（四）紅血球的致敏 1致敏抗原劑量的確定 一般而言，在一定的范圍內，抗原的濃度與試驗的敏感性呈正比，超過這個范圍，再增加抗原，敏感性不會再提高，而且過大，有時會引起非特異性凝集。當采用一種新的抗原時，必須經過試驗，選擇適當?shù)目乖旅魸舛?，即把抗原稀釋成幾個不同的濃度分別致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標準陽性血清進行試驗，與標準陽性血清呈最高滴度的陽性反應的最小抗原劑量，即為該抗原的單位計量。致敏時，根據不同的抗原，可采用24個單位計量進行致敏。2致

18、敏方法 各種抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白質的致敏方法如下：所需濃度的抗原 1 份pH6.4PBS液 4 份2.50的鞣化紅血球懸液 1 份混勻，置37水浴30min，離心，沉淀后，以2.5兔血清生理鹽水洗滌1次，懸浮于1份兔血清生理鹽水中。3影響紅血球致敏的因素 要有高純度或高效價的抗原或抗體。被致敏抗原或抗體的適當劑量和濃度。如抗體一般以g/ml IgG為宜。抗豬瘟IgG一般用80g/ml160g/ml，抗口蹄疫IgG 20g/ml40g/ml，抗豬水泡病IgG 130g/ml160g/ml，抗豬肺疫IgG 30g/ml 40g/ml，抗豬弓形體20g/ml40g/ml，抗原一般用0.2

19、mg/ml1mg/ml。致敏溫度：一般為37，范圍是2040。致敏時間：一般采用30min為最適時間，具有良好的特異性和重復性。也有采用60min。時間過長，會造成紅血球的形態(tài)不整，反應結果紊亂等。血球濃度：一般為1，范圍為0.51.5。（五）操作方法可采用試管法、凹窩板法和微量法。前者稀釋度準確、結果清晰、終點明確。后者具有節(jié)約材料、操作方便、結果出現(xiàn)迅速等優(yōu)點。試管法的供試材料用兔血清鹽水二倍遞減稀釋，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振蕩，混勻后置室溫，紅血球完全沉下（需數(shù)小時）或過夜后判定結果。每次試驗需做下列對照：血清對照：最高濃度的血清鞣酸血球；鞣酸血球對照：兔血清

20、鹽水鞣酸血球；致敏血球對照：兔血清鹽水致敏血球；標準陽性血清對照：稀釋已知滴度的陽性血清，加致敏血球以檢驗試驗的敏感性是否前后一致。（六）結果判定：管底呈細密的顆粒凝集，邊緣不整齊。 ：全管底呈光滑的均勻片層，邊緣折疊。 ：全管底呈光滑的均勻片層，如傘狀。 ：管底大部分復以光滑片層，邊緣稍厚。± ：較“”面積更小，中央有沉積的紅血球。 ：紅血球沉積在管底中央，如小圓盤或鈕扣狀。以“”為滴度終點。五、 間接血凝檢測多殺性巴氏桿菌莢膜抗原（一）材料與試劑1綿羊紅血球2標準多殺性巴氏桿菌莢膜菌種A、B、D、E。3待測莢膜群的多殺性巴氏桿菌4戊二醛（G.R.）5pH7.2的PBS液6阿氏液（

21、Alserers）葡萄糖 2.05g檸檬酸鈉（5H2O） 0.80g檸檬酸（H2O） 0.05g NaCl 0.42g H2O 加至 100.00ml 混合過濾，8磅15min滅菌備用 。（二）操作方法1多殺性巴氏桿菌莢膜抗原的制備 在血清裂解血瓊脂平板上篩選待測的多殺性巴氏桿菌熒光性典型的菌落（熒光性弱的可通過小白鼠或本動物復壯），接種于血清裂解血瓊脂斜面或改良馬丁湯瓊脂斜面，每株接兩管，于37培養(yǎng)16h左右，達融合生長后，用2ml生理鹽水（每管1ml）洗下，收集于小試管中，于56水浴30min，然后以8 000rmin離心30min，取上清液即可。5紅血球 100ml2.5戊二醛溶液 20

22、ml混合后以磁力攪拌器室溫攪拌1h，用生理鹽水洗滌4次，再用pH7.2PBS液配制成50的醛化紅血球懸液（即加至原血量的體積），加1萬硫柳汞防腐，分裝小瓶，置4保存?zhèn)溆谩?紅血球致敏 2ml莢膜抗原加入50醛化紅血球懸液0.20ml，充分混勻，37作用2h，中間輕輕振蕩數(shù)次，離心去上清，再用生理鹽水洗滌一次，最后加入10ml生理鹽水，混勻，即為1的致敏紅血球液。4莢膜高免血清的制備和處理 選Cartor A、B、D、E 標準菌株分別接種于馬丁瓊脂斜面，37培養(yǎng)10h18h，以滅菌生理鹽水洗下，加福爾馬林處理，使其達0.3福爾馬林菌液濃度為200億ml300億ml的懸液。選一歲左右的健康綿羊作為

23、制備莢膜高免血清用的動物。第一次皮下注射加有氫氧化鋁佐劑的死菌抗原2ml，23周后開始用不加佐劑的死菌懸液，每周注射2次，劑量為1ml，1ml，2ml，2ml，3ml，3ml，10ml，最后放血，常規(guī)收獲血清，即為莢膜定型用高免血清。取A、B、D、E標準莢膜高免血清 2ml，置56滅活30min，加入50醛化紅血球0.4ml，37作用2h，離心去紅血球即可。5反應術式，見表5-2(在最后 )各成分加畢后，充分搖勻，置室溫中2h3h觀察結果。（三）結果判定 ： 凝集的紅血球鋪得較寬，或卷邊或有缺口。 ： 凝集的紅血球平鋪管底，呈沙撒布。分布不均勻，邊緣不整齊。 ： 凝集的紅血球面積較小，凝集程度輕微。 ： 紅血球形成小而光滑的圓點或有空心。 以“”為樣品的滴度終點。六、 反向間接血凝檢測豬傳染性水泡病病原（一）材料與試劑1高免血清 以豬傳染性水泡病乳鼠毒苗免疫成年豬，10天后攻毒，攻毒后蹄部發(fā)生水泡。四星期后第二次攻毒，再過二星期，放血收集血清。2免疫球蛋白IgG的提取 以高免血清加等量0.01Mol/l pH 7.0 PBS,逐步滴加飽和硫酸