質(zhì)粒構(gòu)建課件ppt課件

1、 質(zhì)粒構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建11孟慶明孟慶明2019-04-09主要內(nèi)容主要內(nèi)容v質(zhì)粒的概念及特點質(zhì)粒的概念及特點v質(zhì)粒構(gòu)建的基本步驟和原理質(zhì)粒構(gòu)建的基本步驟和原理一、質(zhì)粒的概念一、質(zhì)粒的概念載體載體vector;carrier;vehicle） 可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進入宿主細(xì)胞，并在其中進行可以插入核酸片段、能攜帶外源核酸進入宿主細(xì)胞，并在其中進行獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制的核酸分子。基因工程中廣泛應(yīng)用的載體多獨立和穩(wěn)定的自我復(fù)制的核酸分子?；蚬こ讨袕V泛應(yīng)用的載體多來自人工改造的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒核酸等。多數(shù)載體是來自人工改造的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體或病毒核酸等。多數(shù)載體是DNA分子，但某些分子

2、，但某些RNA分子也能用做載體。分子也能用做載體。質(zhì)粒質(zhì)粒plasmid） 獨立于染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)獨立于染色體外能夠進行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌中染色體以外的雙鏈、閉環(huán)胞器和細(xì)菌中染色體以外的雙鏈、閉環(huán)DNA分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。分為緊密控制型因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。分為緊密控制型(Stringent control)和松馳控制型和松馳控制型(Relaxed cont

3、rol) 4在宿主細(xì)胞中能保存下來并能大量復(fù)制，不影響受體細(xì)胞正常生命活動；有多個限制酶切點MCS），而且每種酶的切點最好只有一個，可適于多種限制酶切割的DNA插入；含有復(fù)制起始位點，能夠獨立復(fù)制；有一定的標(biāo)記基因，便于進行篩選。如pEGFP-n1質(zhì)粒攜帶卡那霉素抗性基因，pcs2質(zhì)粒攜帶氨芐青霉素抗性基因；載體DNA分子大小應(yīng)合適，分子量小1-10KD）、多拷貝、松馳控制型，便于操作及大量擴增，如我們實驗室常用的 pcDNA3.1,pcs2-6myc, pEGFP-n1等。二、質(zhì)粒的特點二、質(zhì)粒的特點55三、質(zhì)粒圖譜閱讀三、質(zhì)粒圖譜閱讀 第一步：首先看Ori的位置，了解質(zhì)粒的類型原核/真核/

4、穿梭質(zhì)粒）。 第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。Ampr 氨芐抗性；kanr 卡那霉素抗性。neor 使G418失活。 第三步：看多克隆位點MCS）。是否具有多個限制酶的單一切點。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。 第五步：是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子核糖體結(jié)合位點克隆位點轉(zhuǎn)錄終止信號。這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。 五步閱讀質(zhì)粒圖譜五步閱讀質(zhì)粒圖譜四、質(zhì)粒構(gòu)建的基本步驟和原理四、質(zhì)粒構(gòu)建的基本步驟和原理 背景介紹：背景介紹： 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)recombinant DNA technology是基因功能研究的基本方

5、法。應(yīng)用是基因功能研究的基本方法。應(yīng)用該技術(shù)可以對該技術(shù)可以對DNA分子進行剪切和重新連接，構(gòu)分子進行剪切和重新連接，構(gòu)成重組成重組DNA分子，然后把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進而分子，然后把它導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進而擴增相關(guān)擴增相關(guān)DNA片段，表達相關(guān)基因的產(chǎn)物?？寺∑?，表達相關(guān)基因的產(chǎn)物?？寺lone是指由一個細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖以后形成是指由一個細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖以后形成的子代群體。構(gòu)建的子代群體。構(gòu)建DNA重組體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞建重組體并導(dǎo)入宿主細(xì)胞建立無性繁殖體系，即立無性繁殖體系，即DNA的分子克隆的分子克隆molecular cloning過程。因此，重組過程。因此，重組DNA技術(shù)又稱為基因技術(shù)又稱

6、為基因克隆技術(shù)或基因工程技術(shù)?？寺〖夹g(shù)或基因工程技術(shù)?；蚩寺ene cloning （以hBex2為例）vTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationTarget geneTarget geneTarget geneTarget geneGene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digest

7、ion & ligationvTransformation & IdentificationVectors with fluorescent tag:pEGFPC1;pEGFPN1;pEYFP;pSUPER;pCS2(GFP)Vectors with non-fluorescent tag:pKH3(3HA);pCS2(6myc);pcDNA3.1(flag);pCMV5(flag);pGEX (GST);VECTORS/vectordb/ Gene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer de

8、signvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationPrimer designPrimer designSense: 5 ATGGAGTCCAAAGAGGAACG 3Primer designAntisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Primer designSense: 5 ATGGAGTCCAAAGAGGAACG 3(Forword) Antisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3(Reverse)?Primer designvBe

9、fore order itv Think about what should be included in linker:Restriction site selectionProtective oligonucleotides for effective cleavageKozak translation initiation site (GCC GCC A/GCC ATG G)Open reading frames (for fusion protein)Stop codon?InsertS? REREORF?K?Search for restriction sitesSearch for

10、 restriction sitesProtective oligonucleotides for effective cleavageCleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides)CGGAATTCCGGGATCCEcoR IBamH Ineb/nebecomm/tech_reference/restriction_enzymes/cleavage_olignucleotides.asp Kozak translation initiation sitevInitiation of translation in euk

11、aryotes.vConsensus sequence: GCC GCC A/GCC ATG Gv -3, 1, 2, 3, 4Open reading framesXX5 GA ATT CEcoR IBamH IG GAT CC 3 EGFPInsert (ATG XXX XXX )Product (fusion protein): Target protein + GFP EcoRI:GA ATT CTG HindIII:XXXOpen reading framesStop codonvTAGvTGAvTAANO AAntisense linker:AAG CTTBamHI:G GAT C

12、CAHindIII: AA GCT TEcoRI: G AAT TCBamHI: GGA TCCXXXSense linker:Open reading framesPrimer design: Stop codonAntisense 5GGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Antisense 5 TCAGGGCATAAGGCAAAACTCATCG 3Sense：hBex2/EcoR I 5-CG GAATTC ATGGAGTCCAAAGAGGAACG-3Antisense：hBex2/BamH I Antisense: 5 -CG GGATCCCG GGGCATAAGGCAAAAC

13、TCATCG-3Sense: 5-CG GAATTC ATGGAGTCCAAAGAGGAACG-35 -CG GGATCCCG GGGCATAAGGCAAAACTCATCG-3Gene cloningvTarget gene: hBex2vVector selectionvPrimer designvAmplification, digestion & ligationvTransformation & IdentificationAmplification (PCR):94C 394C 45 Tm 45 30-40 cycles72C 172C 10Template (cDNA or Pla

14、smid ) Sense primerAntisense primerDNA Polymerase(pfu) dNTP mixBufferddH2ODigestion & ligationPCR product or vectorEnzyme 1Enzyme 210XBuffer 100XBSA(?)ddH2O37C23 hPCR product VectorT4 DNA ligase10Xligase bufferddH2ORT 12 hor 16C O/NCTT CG GAT CCA CCGCGG TG AAT TCG AAGEcoR IBamH IGFPEcoR IBamH I5 G A

15、TC CGC5 A ATT CGCG 3insertG 3 5CGGA ATT CEcoR IBamH IGCG GAT CC 3insertG AAT TC 35 CG GG ATC CGCEcoR I/BamHI digestionCGG TGG ATC CCG XXXXX CAG AAT TCG AAGCTT CGA ATT CTG XXXXXCGG GAT CCA CCGGFPEcoR IBamH IEcoR I/BamHI digestionCTT CG GAT CCA CCGCGG TG AAT TCG AAGinsertG T4 DNA LigaseGFPGCGG ATC CGCA ATT CDigestion & ligationGene cloningvTarget gene: hBex2vVector se