DNA的凝膠電泳

1、DNA的凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠電泳含不同量瓊脂糖的凝膠的分離范圍凝膠中的瓊脂糖含量（w/v）線狀DNA分子的有效分離范圍（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.232.00.12常用電泳緩沖液緩沖液使用液濃儲存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1:0.04mol/L Tris乙酸0.001mol/L EDTA50:242g Tris堿57.1ml冰乙酸100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1:0.09mol/L Tris-磷酸0.002mol/L EDTA10:108g Tris堿15.5ml 85磷酸（1.6

2、79g/ml）40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5:0.045 mol/L Tris-硼酸0.001mol/L EDTA5:54g Tris堿27.5g硼酸20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)堿性緩沖液b1:50mmol/L NaOH1mmol/L EDTA1:5ml 10mol/L NaOH2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)aTBE濃溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5溶液，出現(xiàn)沉淀后則予以廢棄。 以往都以1TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯存液）進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5的使用液已

3、具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖凝膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳使用的1TBE，是瓊脂糖凝膠電泳時使用液濃度的2倍。聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小，故通過緩沖液的電流通量通常較大，需要使用1TBE以提供足夠的緩沖容量。b. 堿性電泳緩沖液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。凝膠加樣緩沖液緩沖液類型6緩沖液貯存溫度0.25溴酚藍(lán)0.25二甲苯青FF40%(w/v)蔗糖水溶液40.25溴酚藍(lán)0.25二甲苯青FF15聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液室溫0.25溴酚藍(lán)0.25二甲苯青FF30甘油水溶液40.25溴酚藍(lán)40%(w/v)蔗糖水溶液4堿性加

4、樣緩沖液300mmol/L NaOH6mmol/L EDTA18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液0.15%溴甲酚綠0.25二甲苯青FF4 使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品濃度，以確保DNA均勻進(jìn)入樣品孔內(nèi)；使樣品呈現(xiàn)顏色，從而使加樣操作更為便利；含有在電場中能以可預(yù)知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍(lán)在瓊脂糖凝膠中泳動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關(guān)。以0.5TBE作電泳液時，溴酚藍(lán)在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.51.4的范圍內(nèi)，這些對應(yīng)關(guān)系受凝

5、膠濃度變化的影響并不顯著。 選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對于堿性凝膠應(yīng)當(dāng)使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因?yàn)樵趬A性pH條件下其顯色較溴酚藍(lán)更為鮮明。2.聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA 在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺（w/v）a有效分離范圍（bp）二甲苯青FFb溴酚藍(lán)b3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512a. N,N-亞甲基雙丙烯酰胺占丙烯酰胺濃度的1/3.b. 給出的數(shù)字是遷移率與染料相同的雙鏈DNA片斷的粗略大小（核苷酸對）30丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29gN,

6、N-亞甲基雙丙烯酰胺 1g 加水至100ml 將溶液加熱至37使化學(xué)藥品溶解小心：丙烯酰胺是強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，可經(jīng)皮膚吸收。丙烯酰胺的作用具有累積性。稱取粉末狀丙烯酰胺及亞甲雙丙烯酰胺時必須帶手套和面具。取用含上述化學(xué)藥品的溶液也要戴手套。盡管可以認(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但鑒于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍應(yīng)小心處理。10過硫酸銨 過硫酸銨 1g加水至10ml可在4保存數(shù)周。制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積（總體積100ml）試劑制備不同濃度（）凝膠所用試劑的毫升數(shù)3.55.08.012.020.030丙烯酰胺11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.7