柴胡皂苷-d對(duì)乙醇損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

1、柴胡皂苷-d對(duì)乙醇損傷原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制研究                        作者：李素婷 姜凌雪 周曉慧 楊鶴梅【摘要】  目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）對(duì)乙醇損傷大鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞保護(hù)的作用和機(jī)制。方法采用胰蛋白酶消化、分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，乙醇體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，以不同濃度的SS-d對(duì)肝細(xì)胞保護(hù)，檢測(cè)培

2、養(yǎng)液中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）活性和肝細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法檢測(cè)肝細(xì)胞存活率。結(jié)果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L1）明顯改善肝細(xì)胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，對(duì)肝細(xì)胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明顯的抑制作用。結(jié)論SS-d對(duì)乙醇損傷大鼠肝細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SS-d清除自由基、抑制質(zhì)脂過氧化作用有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  乙醇 肝細(xì)胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護(hù)作用 機(jī)制隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對(duì)肝臟的損害日漸突出。了解酒精對(duì)肝損傷的機(jī)制，篩選有效預(yù)防和酒精性

3、肝損傷的藥物應(yīng)用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復(fù)方對(duì)酒精性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究和報(bào)道比較多，單味制劑報(bào)道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強(qiáng)。整體水平研究表明柴胡皂苷對(duì)酒精性肝損傷有預(yù)防作用1。本文建立體外乙醇損傷肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究柴胡有效成分SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。    1   器材與方法    1.1  藥品與試劑

4、  SS-d（純度98%），昆明長(zhǎng)春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌,4保存；1.0 g·L1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml1，鏈霉素100 g·ml1，胰島素5  g·ml1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測(cè)定試劑盒，南京建成生物

5、工程研究所。    1.2  動(dòng)物 SD大鼠，24 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級(jí)，承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供。    1.3  儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Bayer公司），721W微機(jī)型分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器五廠），離心機(jī)（TGL.16G 上海）。    1.4  肝細(xì)胞分離培養(yǎng)2取新生24 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結(jié)締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟

6、至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細(xì)胞，加入0.8g·L1胰蛋白酶10 ml,37孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細(xì)胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)>85%，按1 ×109個(gè)·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。    1.5   乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)

7、胞損傷模型的建立將含肝細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔板，設(shè)正常對(duì)照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L14個(gè)劑量組，肝細(xì)胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測(cè)定ALT活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞存活率。    16   MTT法選擇SS-d的實(shí)驗(yàn)濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L1。將肝細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設(shè)空白對(duì)照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT20

8、0 L，37孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 l，混勻以溶解被還原的MTT結(jié)晶，檢測(cè)波長(zhǎng)為492   nm的光密度值，藥物不同稀釋濃度下細(xì)胞的存活率。    1.7   SS-d對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用取培養(yǎng)72 h肝細(xì)胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L1)3個(gè)劑量保護(hù)組、正常對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L1，同時(shí)SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對(duì)照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測(cè)A

9、LT活性，收集肝細(xì)胞檢測(cè)MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測(cè)定肝細(xì)胞的存活率。    1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2   結(jié)果    2.1   乙醇對(duì)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L1作用不明顯，光鏡下細(xì)胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細(xì)胞存活率呈進(jìn)行性降低

10、，反映肝細(xì)胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L1制備肝細(xì)胞損傷模型。見表1。表1  不同濃度乙醇對(duì)肝細(xì)胞ALT水平及細(xì)胞存活率的影響 與空白對(duì)照組比較#P0.05，#P0.01；n=6    2.2   SS-d 實(shí)驗(yàn)濃度的選擇SS-d不同濃度時(shí)細(xì)胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細(xì)胞毒性作用，應(yīng)選擇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響即肝細(xì)胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0

11、mg·L-1)作為實(shí)驗(yàn)所用藥物濃度。見表2。表2  不同濃度SS-d對(duì)肝細(xì)胞存活率的影響與空白對(duì)照組比較，#P0.05，#P0.01；n=61             2.3   SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞的保護(hù)作用 100 mmol·L1乙醇作用肝細(xì)胞后，肝細(xì)胞損傷明顯，大量細(xì)胞壞死，細(xì)胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯增高,GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護(hù)后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細(xì)胞MDA含量明顯降

12、低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細(xì)胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P0.05，P0.01)。表明：SS-d能夠保護(hù)肝細(xì)胞、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。見表3。表3  SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞ALT，MDA，GSH-px水平與對(duì)照組比較，*P0.01,與模型組比較#P0.05,#P0.01；n=6    3  討論    大量研究表明，乙醇對(duì)肝細(xì)胞損傷是通過自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行的35。乙醇在肝臟代謝時(shí)產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細(xì)胞外，可引起肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧

13、化反應(yīng)，使細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動(dòng)性失常，大量肝內(nèi)酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細(xì)胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細(xì)胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致細(xì)胞腫脹死亡6。因此，清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，才能保護(hù)肝細(xì)胞，恢復(fù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。    SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用7，8。但對(duì)單體SSd保肝作用研究報(bào)道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細(xì)胞損傷模型，在細(xì)胞水平上對(duì)SS-d保肝作用機(jī)制進(jìn)行探討。本研究顯示，模型組肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT

14、活性明顯升高，肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細(xì)胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細(xì)胞氧化損傷；給予SSd保護(hù)后，和模型組比較，肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細(xì)胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞有明顯保護(hù)作用，其機(jī)制可能是：SS-d能增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；穩(wěn)定肝細(xì)胞膜系統(tǒng)，提高膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，防止肝細(xì)胞損傷和壞死?！尽?#160; 1 李素婷，齊潔敏，楊鶴梅，等. 柴胡總提物對(duì)大鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用J.承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，24（1）：9.2 謝華福

15、，甘 淋，李 娟，等. 一種簡(jiǎn)單的肝細(xì)胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法J.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，26（4）：306.3 Sergent O,Pereira M,Belhomme C,et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytesJ. J Pharmacol Exp Ther,2005,1:5. 4 Stewart SF,Vidali M,Day CP,et al.Oxidative stress as a trigger for cellular responses in patients with alcoholic liver diseaseJ. Hepatology,2004,39:197.5 鄧 源，班春林，武曉瓊. 乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機(jī)制的研究進(jìn)展J. 華北國(guó)際醫(yī)藥，2005，17（