構(gòu)象敏感凝膠電泳用于檢測乙型肝炎病毒P區(qū)核苷類似物耐藥準(zhǔn)種的

1、    構(gòu)象敏感凝膠電泳用于檢測乙型肝炎病毒P區(qū)核苷類似物耐藥準(zhǔn)種的初步研究劉霖,湯影子,王宇明,王小紅,周吉軍,李俊剛(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍感染病研究所,重慶400038)提要:目的建立經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、準(zhǔn)確的乙型肝炎病毒準(zhǔn)種分析方法。方法采用“PCR-克隆-測序”的方法,對2例血清樣本的各60個(gè)克隆測序,2檢驗(yàn)分析所研究克隆毒株的數(shù)量對準(zhǔn)種組成反映準(zhǔn)確性的影響;用建立的構(gòu)象敏感凝膠電泳(CSGE)法區(qū)分克隆目的片段,比對CSGE結(jié)果與測序結(jié)果的一致性。結(jié)果對于優(yōu)勢準(zhǔn)種比例的反映檢測15個(gè)克隆以上(2=2. 700,P=0·100>0.

2、05)、對劣勢株的檢出檢測30個(gè)以上則與檢測60個(gè)克隆無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(2=2. 411,P>0. 05);比較8個(gè)樣本共270個(gè)克隆的CSGE及測序結(jié)果,兩者表現(xiàn)出良好的對應(yīng)性(準(zhǔn)確率達(dá)98. 9% )。結(jié)論用“PCR-克隆-CSGE-測序”的方法視不同需求檢測15或30個(gè)克隆可準(zhǔn)確反映1份血清樣本中HBV準(zhǔn)種的組成和分布。高變異病毒的準(zhǔn)種(quasispecies)研究目前受研究方法的限制,仍主要采用“PCR-克隆-測序”的方法。但究竟多少個(gè)克隆能準(zhǔn)確反映病毒種群整體的準(zhǔn)種組成和分布目前仍不清楚。另外,構(gòu)象敏感凝膠電泳(conformation sensitive gel eletrop

3、horesis, CSGE)是常用的核酸區(qū)分方法,但其精確性尚未進(jìn)行較大樣本的測序驗(yàn)證。同時(shí), CSGE檢測對于特定的目的片段需要專一的驅(qū)動子進(jìn)行CSGE檢測。核苷類似物耐藥是目前困擾臨床抗乙型肝炎病毒(HBV)治療的難題,目前尚少見針對所有已知核苷類似物耐藥位點(diǎn)的CSGE方法報(bào)道。本研究對2份慢性乙型肝炎患者血清樣本的各60個(gè)克隆進(jìn)行測序和序列分析,另對8份慢性乙型肝炎血清樣本進(jìn)行準(zhǔn)種分析,比對CSGE和測序結(jié)果,驗(yàn)證CSGE的可靠性。1材料與方法1. 1血清樣本10份血清樣本分別來自2例慢性乙型肝炎患者(表1)。1. 2目的片段的PCR擴(kuò)增和克隆采用巢式PCR, Primer Premie

4、r 5. 0軟件自行設(shè)計(jì)引物,引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。外側(cè)引物Prt-Outer-1(533553 nt): 5-CCTGCTCAAGGAACCTCTATG-3, Prt-Outer-2(1 1971 177 nt): 5-GGTTGCGTCAGCAAACACTTG-3;內(nèi)側(cè)引物Prt-Inner-1(599617 nt): 5-TGTATTCCCATCCCATCAT-3, Prt-In-ner-2(992970 nt): 5-TGACATACTTTCCAATCAATCAATAGG-3。目的片段包括Prt區(qū)的B、C、D、E 4個(gè)區(qū)域(394 bp),涵蓋了目前已知的所有HBV核苷類抗病

5、毒藥物耐藥突變位點(diǎn)(表2)。采用日本寶生物公司的ExTaq酶。擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌,對每個(gè)血清樣本隨機(jī)挑取80個(gè)白色菌落作為模板進(jìn)行內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增,選取60個(gè)PCR陽性菌落測序;用于鑒定CSGE與測序符合度的樣本挑取40個(gè)白色菌落擴(kuò)增。表1血清樣本資料血清樣本藥物治療時(shí)間(周)HBV DNA(log10拷貝/ml)ALT(IU/L)1-1 LAM/0 9. 235 1061-2 LAM/60 4. 316 422-1 LAM/0 9. 342 2822-2 LAM/24 5. 614 642-3 LAM/48 5. 712 302-4 LAM/72 8. 314 148

6、2-5 LAM/96 8. 428 5282-6 ETV/12 6. 484 392-7 ETV/24 6. 605 402-8 ETV/48 5. 281 75LAM:拉米夫定;ETV:恩替卡韋表2已知的全部HBV核苷類抗病毒藥物耐藥突變位點(diǎn)藥物I169T V173L L180M A181V T184A/G S202I/G M204I M204V N236T M250VLAM ADV ETV L-dtLAM:拉米夫定;ADV:阿德福韋;ETV:恩替卡韋;L-dt:特比夫定1. 3CSGE檢測參照Ganguly等1和蘭林等2建立并優(yōu)化的方法。隨機(jī)選取1個(gè)克隆的內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物作驅(qū)動子,進(jìn)而篩選出

7、能良好區(qū)分各個(gè)克隆的驅(qū)動子,再用篩選出的驅(qū)動子對各個(gè)克隆進(jìn)行檢測。1. 4序列分析前兩份標(biāo)本各選取60個(gè)PCR陽性的克隆,另8份標(biāo)本則選取所有作了CSGE篩檢的共270個(gè)克隆送上海生工生物工程有限公司測序,測序儀ABI 3730。測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11. 5統(tǒng)計(jì)軟件行2檢驗(yàn)。2結(jié)果2. 1目的片段的克隆每個(gè)LB平板上獲得2002 000個(gè)轉(zhuǎn)化克隆,其中70%以上為白色菌落。每份標(biāo)本隨機(jī)挑選40或80個(gè)克隆行PCR擴(kuò)增, 80%以上含有插入片段。選取PCR擴(kuò)增陽性克隆用于測序或CSGE檢測。2. 2反映HBV準(zhǔn)種整體的最小克隆數(shù)優(yōu)勢準(zhǔn)種是指在準(zhǔn)種群體中所

8、占比例最大的克隆毒株,相對優(yōu)勢準(zhǔn)種有次優(yōu)勢準(zhǔn)種,所占比例很小的為劣勢準(zhǔn)種。為了將每個(gè)樣本需研究的克隆數(shù)量減至最少同時(shí)又不影響對準(zhǔn)種整體的反映情況,從60個(gè)陽性克隆的測序結(jié)果中隨機(jī)選出10、15、2055個(gè)克隆序列分為10組,比較各組與整體(60個(gè)克隆)之間對于優(yōu)勢株反映和劣勢株檢出的差異。發(fā)現(xiàn)對于優(yōu)勢株的反映,只需檢測15個(gè)克隆以上即與整體無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(210=4. 587,P10=0. 032;215=2. 700,P15=0. 100);而對于劣勢株的檢出,則需檢測30個(gè)克隆以上(225=4. 225,P25=0.040;230=2. 411,P30=0. 120)。2. 3克隆片段的CS

9、GE分析CSGE檢測需要敏感的驅(qū)動子,而驅(qū)動子是片段特異的,即1個(gè)驅(qū)動子只能驅(qū)動1個(gè)特異的DNA片段,而理想的驅(qū)動子能夠在和目的片段雜交后在CSGE電泳膠中一般產(chǎn)生24條可被清晰區(qū)分的條帶,無條帶模糊( fuzzy)等現(xiàn)象。通過反復(fù)篩選,得到了比較理想的驅(qū)動子(圖1)。用篩選出的驅(qū)動子與血清樣本27的32個(gè)克隆的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后得到優(yōu)化后的CSGE圖譜,見圖2。繼而對8例血清標(biāo)本的共270個(gè)克隆進(jìn)行CSGE檢測,并全部測序,發(fā)現(xiàn)CSGE檢測與測序結(jié)果的對應(yīng)性達(dá)到98. 9%。(條帶3):篩選出的比較理想的構(gòu)象敏感凝膠電泳(CSGE)驅(qū)動子。1、2、4、5:是不適合作驅(qū)動子的克隆目的片段圖1

10、構(gòu)象敏感凝膠電泳理想驅(qū)動子的篩選132:32個(gè)克隆的CSGE圖譜;D:驅(qū)動子,驅(qū)動子自身經(jīng)變性復(fù)性后在CSGE膠上電泳圖譜為單一條帶;M:標(biāo)準(zhǔn),由于CSGE采用變性PAGE膠,因此普通雙鏈DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)僅有相對指示作用圖2優(yōu)化后的CSGE圖譜3討論對抗病毒藥物的選擇標(biāo)準(zhǔn)及治療中藥物的調(diào)整,目前缺乏直接可靠的病毒學(xué)依據(jù)。HBV準(zhǔn)種群體在抗病毒治療過程中組成和分布發(fā)生著動態(tài)變化,從而導(dǎo)致HBV準(zhǔn)種群作為一個(gè)整體其藥物敏感性和抗性發(fā)生演變,反過來影響抗病毒治療效果3, 4。故對HBV準(zhǔn)種組成進(jìn)行定期檢測,使其成為抗HBV治療的“藥敏試驗(yàn)”有重要意義。目前一般每個(gè)血清樣本克隆測序數(shù)量為2060個(gè)。本

11、研究表明,僅需檢測15個(gè)克隆即可準(zhǔn)確反映HBV準(zhǔn)種群體中優(yōu)勢株的比例,而要準(zhǔn)確反映劣勢株在HBV準(zhǔn)種群體中的比例則需檢測至少30個(gè)克隆。CSGE檢測的敏感性取決于對驅(qū)動子的篩選,我們篩選出的驅(qū)動子與目的片段雜交后可得到24條清晰的電泳條帶,無明顯的條帶模糊(fuzzy)現(xiàn)象。本研究建立的檢測HBV Prt區(qū)全部已知核苷類似物耐藥突變的CSGE方法可區(qū)分兩個(gè)不同克隆目的片段間小至1bp的堿基差異,因此可僅對CSGE條帶不同的克隆進(jìn)行測序,大大降低了成本。CSGE較傳統(tǒng)的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)或異源雙鏈分析(HDA)方法提高了檢測精度,此二者的結(jié)合法SSCP/HDA5理論上有更高的檢測精度,但

12、操作要求稍高。新方法如毛細(xì)管電泳雙鏈泳動分析及基于實(shí)時(shí)定量PCR的變異檢測技術(shù)等需要昂貴設(shè)備的支持,同時(shí)亦不完善,不推薦為普通實(shí)驗(yàn)室的首選方法。關(guān)鍵詞:肝炎病毒,乙型;準(zhǔn)種;構(gòu)象敏感凝膠電泳;方法學(xué)中圖法分類號:R446. 11文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B參考文獻(xiàn):1 GangulyA, RockM J, Prockop D J. Conformation-sensitive gel electrophoresis for rapid detection ofsingle-base differences in double-stranded PCR products and DNA fragments:

13、evidence for solvent-inducedbends in DNA heteroduplexesJ. Proc NatlAcad SciU S A, 1993,90(21): 10325-10329.2蘭林,王宇明.構(gòu)象敏感凝膠電泳快速檢測HBV準(zhǔn)種序列異質(zhì)性的方法J.世界華人消化雜志, 2002, 10(4): 411-414.3 PallierC, Castera L, SoulierA,et al. Dynamics of hepatitis B virusresistance to lamivudineJ. JViro,l 2006, 80(2): 643-653.4 Yim H J, HussainM, Liu Y,et al. Evolution ofmulti-drug resistanthepatitisB virus during sequential therapyJ. Hepatology, 2006, 44