分子生物學(xué)研究方法上課件

1、分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上第五章第五章 分子生物學(xué)研究方法（上）分子生物學(xué)研究方法（上）DNA、RNA、蛋白質(zhì)操作技術(shù)、蛋白質(zhì)操作技術(shù)從從20世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速世紀(jì)中葉開始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法，發(fā)展，主要原因之一是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步?；虿僮髦饕ɑ虿僮髦饕―NA分子的切割與連接、核分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定點(diǎn)突變和以及基因的人工合

2、成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 5.1 重組重組DNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧 5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) 5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) 5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用 5.5 基因克隆技術(shù)基因克隆技術(shù) 5.6 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)回顧回顧5.1.1 5.1.1 重組重組DNADNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)5.1.2 5.1.2 關(guān)鍵性

3、實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組DNADNA技術(shù)奠基技術(shù)奠基 5.1.3 5.1.3 重組重組DNADNA技術(shù)的概念技術(shù)的概念5.1.4 5.1.4 重組重組DNADNA技術(shù)的基本步驟技術(shù)的基本步驟 5.1.5 5.1.5 重組重組DNADNA技術(shù)的意義技術(shù)的意義 5.1.6 5.1.6 重組重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶5.1.7 5.1.7 目的基因的來(lái)源目的基因的來(lái)源5.1.8 5.1.8 重組實(shí)驗(yàn)中的基因載體重組實(shí)驗(yàn)中的基因載體分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧 4040年代明確了遺傳的物

4、質(zhì)基礎(chǔ)是年代明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA DNA 5050年代揭示了年代揭示了DNA DNA 分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息保留復(fù)制，解決了基因的自我復(fù)制和遺傳信息傳遞問題傳遞問題 。 5050年代末和年代末和6060年代提出了年代提出了“中心法則中心法則”和操縱和操縱子學(xué)說(shuō)，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明子學(xué)說(shuō)，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。 5.1.1 5.1.1 重組重組DNADNA技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)技術(shù)誕生的理論基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1.2 5

5、.1.2 關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)技術(shù)問世為重組DNADNA技術(shù)奠基技術(shù)奠基 1 1、DNADNA分子的切割與連接技術(shù)分子的切割與連接技術(shù) 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(1972)(1972)和連接酶和連接酶(1967)(1967)的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才的陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，才使分子生物學(xué)家有了進(jìn)行使分子生物學(xué)家有了進(jìn)行DNADNA操作的基本工具。操作的基本工具。 2 2、載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立、載體構(gòu)建和大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立 19701970年年M.MandelM.Mandel和和A.HigeA.Hige發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過(guò)氯化發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的細(xì)胞經(jīng)過(guò)氯化鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收

6、鈣適當(dāng)處理之后，便能吸收噬菌體的噬菌體的DNADNA。19721972年美國(guó)年美國(guó)斯坦福大學(xué)斯坦福大學(xué)S.CohenS.Cohen報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞報(bào)道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒也能攝取質(zhì)粒DNADNA。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對(duì)重組。大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立，對(duì)重組DNADNA技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。技術(shù)的創(chuàng)立具有特別重要的意義。 3 3、SouthernSouthern雜交、雜交、DNADNA序列分析和聚合酶鏈反應(yīng)序列分析和聚合酶鏈反應(yīng) 5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)

7、研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上Southern印跡結(jié)果印跡結(jié)果分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)(recombinant DNA technique): (recombinant DNA technique): 是是按照人們意愿，在體外對(duì)按照人們意愿，在體外對(duì)DNADNA分子進(jìn)行重組分子進(jìn)行重組, ,再將再將重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該殖，以獲得該DNADNA的大量拷貝。的大量拷貝。 基因克隆基因克隆(gene cloning) (gene cloning) 分子克隆分子

8、克隆(molecular cloning) (molecular cloning) 5.1.3 5.1.3 重組重組DNADNA技術(shù)的概念技術(shù)的概念5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧克隆克隆來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1.4 5.1.4 重組重組DNADNA技術(shù)的基本步驟技術(shù)的基本步驟 1 1、四大要素、四大要素 外源基因（目的基因）外源基因（目的基因） 載體載體 工具酶工具酶 受體細(xì)胞受體細(xì)胞 5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2 2

9、、重組、重組DNADNA技術(shù)的基本步驟技術(shù)的基本步驟 目的基因的獲得與載體的制備目的基因的獲得與載體的制備 目的基因與載體目的基因與載體DNADNA的連接的連接 重組重組DNADNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞 重組體的篩選與重組重組體的篩選與重組DNADNA的鑒定的鑒定 克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分克隆基因的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化離純化 5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上重組重組DNADNA技術(shù)操作的主要步驟技術(shù)操作的主要步驟載體載體質(zhì)粒質(zhì)粒噬菌體噬菌體病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因組基因組DN

10、A cDNA 人工合成人工合成PCR產(chǎn)物產(chǎn)物限制酶消化限制酶消化開環(huán)載體開環(huán)載體DNADNA目的基因目的基因連接酶連接酶重組體重組體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主帶重組體的宿主篩選篩選表型篩選表型篩選酶切電泳鑒定酶切電泳鑒定菌落原位雜交菌落原位雜交5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上重組重組DNADNA技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為：技術(shù)操作過(guò)程可形象歸納為： 分分分離目的基因分離目的基因 切切限制酶切目的基因與載體限制酶切目的基因與載體接接拼接重組體拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩篩選重組體篩選重組體 分子生物

11、學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1.5 5.1.5 重組重組DNADNA技術(shù)的意義技術(shù)的意義 重組重組DNADNA技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝技術(shù)填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝 重組重組DNADNA技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間技術(shù)縮短了進(jìn)化時(shí)間 重組重組DNADNA技術(shù)使人能對(duì)生物進(jìn)行定向改造技術(shù)使人能對(duì)生物進(jìn)行定向改造 體外大量擴(kuò)增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，體外大量擴(kuò)增、研究其結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控機(jī)制，從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對(duì)醫(yī)學(xué)上從而拓寬了分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域，這對(duì)醫(yī)學(xué)上各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意各種疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。義。 5.1 5.1

12、 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上酶類酶類功能功能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開識(shí)別并在特定位點(diǎn)切開DNADNADNADNA連接酶連接酶通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片段連接成一個(gè)片段連接成一個(gè)DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶按按5 5到到3 3方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平方向加入新的核苷酸，補(bǔ)平DNADNA雙鏈中的雙鏈中的缺口缺口反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶按照按照RNARNA分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合分子中的堿基序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則合成成DNADNA鏈鏈多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸

13、基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的把磷酸基團(tuán)加到多聚核苷酸鏈的5 5-OH-OH末端末端末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶在雙鏈核酸的在雙鏈核酸的3 3末端加上多聚單核苷酸末端加上多聚單核苷酸DNADNA外切酶外切酶從從DNADNA鏈的鏈的3 3末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸噬菌體噬菌體DNADNA外切酶外切酶從從DNADNA鏈的鏈的5 5末端逐個(gè)切除單核苷酸末端逐個(gè)切除單核苷酸堿性磷酸酯酶堿性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA鏈鏈5 5或或3 3末端的磷酸基團(tuán)末端的磷酸基團(tuán)5.1.6 5.1.6 重組重組DNADNA實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶實(shí)驗(yàn)中常見的主要工具酶5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技

14、術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)(restriction endonuclease, RE)一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶.1972年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)內(nèi)切核酸酶EcoR。 分類分類:、（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）5.15.1、 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第一個(gè)字母取自產(chǎn)

15、生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上類酶識(shí)別序列特點(diǎn)類酶識(shí)別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)即反相重復(fù)結(jié)構(gòu)，是 DNA分子中以某一處為軸，其兩側(cè)核苷酸排列呈回文對(duì)稱的序列。切口切口

16、 ：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 DNADNA連接酶連接酶: : 通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)通過(guò)磷酸二酯鍵把兩個(gè)或多個(gè)DNADNA片片斷連接成一個(gè)整體斷連接成一個(gè)整體DNADNA分子。分子。19671967年相繼發(fā)現(xiàn)。年相繼發(fā)現(xiàn)。 T T4 4DNADNA連接酶

17、連接酶 EcoR I EcoR I 連接酶連接酶 T T7 7DNADNA連接酶連接酶5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上n 化學(xué)合成法化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列氨基酸序列 。n 基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)(genomic DNA library)n cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library)n 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧5.1.7 目的基因的來(lái)源目的

18、基因的來(lái)源分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上化學(xué)合成法獲取目的基因化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。序列。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷基因片斷克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所由克隆載體所攜帶的所有基因組有基因組DNA的集合的集合從基因組從基因組DNA文文庫(kù)獲取目的基因庫(kù)獲取目的基因分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上限制酶

19、切位點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化限制酶消化 除去中間片段除去中間片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色體色體DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA與載體與載體DNA混合混合 連接反應(yīng)連接反應(yīng) 體外包裝體外包裝 用重組噬菌體用重組噬菌體感染大腸桿菌感染大腸桿菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文庫(kù)基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)片段構(gòu)建基因文庫(kù) 分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上mRNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNA 重組重組DN

20、A分子分子 cDNA文庫(kù)文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 載體載體 受體菌受體菌 復(fù)制復(fù)制 從從cDNA文庫(kù)獲取目的基因文庫(kù)獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶堿水解堿水解 T T T T分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.1.8 5.1.8 重組實(shí)驗(yàn)中的基因載體重組實(shí)驗(yàn)中的基因載體定義：定義：為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNADNA分分子。子。5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研

21、究方法上克隆載體克隆載體(cloning vector)(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) (expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNADNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)載體的選擇標(biāo)準(zhǔn) 能自主復(fù)制能自主復(fù)制； 具有兩

22、個(gè)以上的具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選物，便于重組體的篩選和鑒定；和鑒定； 有克隆位點(diǎn)有克隆位點(diǎn)（外源（外源DNADNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)； 分子量小，以容納較大的外源分子量小，以容納較大的外源DNADNA。5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 噬菌體載體：噬菌體載體：雙鏈DNA病毒，約50kb,兩端有一個(gè)12個(gè)核苷酸5端突出粘性末端 噬菌體噬菌體 黏粒、黏粒、YACYAC、BAC BAC ：高容量載

23、體高容量載體5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上克隆載體所容納的外原克隆載體所容納的外原DNA片段的大小片段的大小 質(zhì)粒：質(zhì)粒：10kb 噬菌體：噬菌體：23kb 黏粒：黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 以以 質(zhì)質(zhì) 粒粒 為為 載載 體體 的的DNA 克克 隆隆 過(guò)過(guò) 程程5.1 5.1 重組重組DNADNA技術(shù)回顧技術(shù)回顧分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.2.1 核酸凝膠電泳

24、技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)5.2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖分子的增殖5.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)）技術(shù)5.2.4 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)技術(shù)5.2.5 基因組基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)構(gòu)建分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 在生理?xiàng)l件下，核酸分子之戊糖在生理?xiàng)l件下，核酸分子之戊糖-磷酸骨架中的磷酸基磷酸骨架中的磷酸基團(tuán)，呈離子化狀態(tài)，團(tuán)，呈離子化狀態(tài)，DNA和和RNA多核苷酸鏈稱為多聚陰多核苷酸鏈稱為多聚陰離子，把它們放置在電場(chǎng)當(dāng)中，會(huì)向正電極的方向遷移離子，把它們放置在電場(chǎng)當(dāng)中，會(huì)向正電極的方向遷移。由于戊糖。由于戊糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的

25、重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。的速度向正電極方向遷移。 在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNADNA分子的遷移速度，取分子的遷移速度，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。這就是應(yīng)用凝膠電泳技術(shù)分離凝膠電泳技術(shù)分離DNADNA片段的基本原理片段的基本原理。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.2.1 核酸凝膠電泳技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)

26、瓊脂糖凝膠電泳：分辨力瓊脂糖凝膠電泳：分辨力0.250kb （常用）（常用）聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨力聚丙烯酰胺凝膠電泳：分辨力11000bp核酸分析核酸分析凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小；凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大?。荒z濃度越大，空隙越小，其分辨能力越強(qiáng)；凝膠濃度越大，空隙越小，其分辨能力越強(qiáng)；反之，凝膠濃度越低，空隙越大，分辨能力越小。反之，凝膠濃度越低，空隙越大，分辨能力越小。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2022-1-3136n 在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（EtBr）染）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，

27、然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中下觀察，可靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有帶中僅含有0.05g的微量的微量DNA，也可以被清晰地檢測(cè)出，也可以被清晰地檢測(cè)出來(lái)。來(lái)。 n 溴化乙錠能插入到溴化乙錠能插入到DNA或或RNA分子的相分子的相鄰堿基之間，并在鄰堿基之間，并在300nm的紫外線照射下發(fā)的紫外線照射下發(fā)出熒光。出熒光。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)n 熒光染料：溴化乙錠（熒光染料：溴化乙錠（EtBrEtBr）分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 溴化乙錠染溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)其

28、對(duì)DNA分子的分子的插入作用。由于插入作用。由于插入了溴化乙錠插入了溴化乙錠分子，在紫外光分子，在紫外光照射下，瓊脂糖照射下，瓊脂糖凝膠電泳中凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易橘黃色熒光，易于鑒定。于鑒定。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2022-1-3140 普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于普通的瓊脂糖凝膠電泳，很難分離大于50kb的的DNA分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要分子，而要進(jìn)行超大分子研究，要用到脈沖電場(chǎng)凝膠電泳。用到脈沖電場(chǎng)凝膠電泳

29、。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2022-1-3141 所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。傳改變的生命過(guò)程。 提供轉(zhuǎn)化提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株；的菌株叫作供體菌株； 接受轉(zhuǎn)化接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。5.2.2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖分子的增殖5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2

30、 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)轉(zhuǎn)化（轉(zhuǎn)化（transformationtransformation） ：P163P163感受態(tài)細(xì)胞（感受態(tài)細(xì)胞（Competent cells） ：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl2等化等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，能容許有外源化，能容許有外源DNA的載體分子通過(guò)，處于的載體分子通過(guò)，處于這種狀態(tài)下的細(xì)胞稱這種狀態(tài)下的細(xì)胞稱將異源將異源DNADNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀獲得新的遺傳性狀轉(zhuǎn)導(dǎo)？轉(zhuǎn)導(dǎo)？ 轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)染？ 感

31、染？感染？分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上常用的轉(zhuǎn)化方法：常用的轉(zhuǎn)化方法： 化學(xué)轉(zhuǎn)化（化學(xué)轉(zhuǎn)化（CaCl2）法）法 電擊法電擊法 重組重組DNA分子的體外包裝法分子的體外包裝法5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上n 化學(xué)轉(zhuǎn)化原理：化學(xué)轉(zhuǎn)化原理： 將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于0冷凍處理時(shí)，冷凍處理時(shí)，處于處于CaCl 2低滲溶液中的大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球形，低滲溶液中的大腸桿菌細(xì)胞膨脹成球形，DNA可吸附于其表面?？晌接谄浔砻妗?在在42下做下做短暫的熱短暫的熱刺激刺激下，外源下，外源DNA即被細(xì)即被細(xì)胞吸收。胞吸收。 將

32、轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源帶有外源DNA分子的陽(yáng)性克隆。分子的陽(yáng)性克隆。 陽(yáng)性克隆陽(yáng)性克隆在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)n CaCl 2 法是制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞最常用的方法。法是制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞最常用的方法。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上n 電擊轉(zhuǎn)化：一種高效方法。電擊轉(zhuǎn)化：一種高效方法。使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)高壓脈沖的作

33、用將載體高壓脈沖的作用將載體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。分子導(dǎo)入受體細(xì)胞。菌液：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期菌液：生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期場(chǎng)強(qiáng)場(chǎng)強(qiáng)(最大轉(zhuǎn)化效率最大轉(zhuǎn)化效率)：12.5-15kV/cm 溫度：溫度：0-4 5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上P1655.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)重組重組DNA分子分子的體外包裝法的體外包裝法分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上DNA克隆的篩選：克隆的篩選： 抗生素抗性基因?？股乜剐曰?。 常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、常用的抗生素有

34、：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等四環(huán)素、鏈霉素等 -互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選 營(yíng)養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）營(yíng)養(yǎng)條件（自養(yǎng)、異養(yǎng)）5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 Antibiotic resistance genes5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 direct selectionThe procedure to form recombinant DNA 分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 - -互補(bǔ)篩選互補(bǔ)篩選5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)n 質(zhì)粒：攜帶質(zhì)粒：攜帶-半乳糖苷

35、酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控）的調(diào)控序列和氨基端（序列和氨基端（N端）端）146個(gè)氨基酸編碼序列。個(gè)氨基酸編碼序列。n 大腸桿菌：攜帶大腸桿菌：攜帶-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）羧基端）羧基端（C端）部分編碼序列。端）部分編碼序列。 只有只有LacZ的的N端和端和C端全部表達(dá)，酶才有活性。端全部表達(dá)，酶才有活性。n IPTG/X-gal的培養(yǎng)基上篩選藍(lán)白斑的培養(yǎng)基上篩選藍(lán)白斑分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色）（白色） （藍(lán)色）（藍(lán)色） Lac Z（失活）（失活） , IPTG X-gal

36、 X-gal （白色）（白色） （白色）（白色）5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 互互補(bǔ)補(bǔ)的的檢檢測(cè)測(cè)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上藍(lán)白斑藍(lán)白斑5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率的計(jì)算： 轉(zhuǎn)化體總數(shù)菌落數(shù)轉(zhuǎn)化體總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積（轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積/涂涂板菌液體積）板菌液體積） 插入頻率白色菌落數(shù)插入頻率白色菌落數(shù)/藍(lán)色菌落數(shù)藍(lán)色菌落數(shù)+白色菌落數(shù)白色菌落數(shù) 轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化體總數(shù)轉(zhuǎn)化頻率轉(zhuǎn)化體總數(shù)/加入質(zhì)粒加入質(zhì)粒DNA的量（計(jì)算的量（計(jì)算出每微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）出每

37、微克的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)）5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)）技術(shù) 1985年，年，K.Mullis等研究成功的一種在體外等研究成功的一種在體外快速擴(kuò)增特定基因快速擴(kuò)增特定基因DNA序列的方法序列的方法 原理：類似于天然的原理：類似于天然的DNA復(fù)制過(guò)程。將待擴(kuò)復(fù)制過(guò)程。將待擴(kuò)增的增的DNA片段和兩側(cè)互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引片段和兩側(cè)互補(bǔ)的兩段寡核苷酸引物，經(jīng)過(guò)變性，退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，物，經(jīng)過(guò)變性，退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)2n 倍倍5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分

38、子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上反應(yīng)體系反應(yīng)體系 模板模板DNA：待擴(kuò)增的目的片段 特異性引物：特異性引物：人工合成的與待擴(kuò)增的靶DNA兩端序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶聚合酶 dNTP 含有含有Mg2+的緩沖液的緩沖液5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上PCRPCR的基本反應(yīng)步驟：的基本反應(yīng)步驟：1. 1. 變性變性：9595，模板，模板DNADNA變性為單鏈；變性為單鏈；2. 2. 退火退火：5050左右，使引物與模板左右，使引物與模板DNADNA退火結(jié)合；退火結(jié)合；3. 3. 延伸延伸：7272，DNADNA聚合酶以聚

39、合酶以dNTPdNTP為底物催化為底物催化 DNADNA的合成反應(yīng)。的合成反應(yīng)。上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，經(jīng)25-3025-30次循次循 環(huán)后，可將模板環(huán)后，可將模板DNADNA擴(kuò)增達(dá)百萬(wàn)倍。擴(kuò)增達(dá)百萬(wàn)倍。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCRPCR基本反應(yīng)步驟基本反應(yīng)步驟5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上Cycle 35 5 5 5

40、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴(kuò)大可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。萬(wàn)倍以上。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上PCR技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用技術(shù)在基因克隆方面的應(yīng)用 （1）目的基因的直接克隆，）目的基因的直接克隆， （2）通過(guò)）通過(guò)RT-PCR進(jìn)行進(jìn)行cDNA的克隆；的克??； （3）制備）制備DNA探針，進(jìn)行分子檢測(cè)等。探針，進(jìn)行分子檢測(cè)等。 5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物模板與反應(yīng)中，當(dāng)引物模板與DNA聚合酶達(dá)

41、到一定比值聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，時(shí)，DNA聚合酶催化的反應(yīng)趨于飽和，出現(xiàn)聚合酶催化的反應(yīng)趨于飽和，出現(xiàn)“平臺(tái)效平臺(tái)效應(yīng)應(yīng)”，即，即PCR反應(yīng)產(chǎn)物不再增加。反應(yīng)產(chǎn)物不再增加。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上定量定量PCRPCR與定性與定性PCRPCR測(cè)定測(cè)定 指數(shù)擴(kuò)增期指數(shù)擴(kuò)增期擴(kuò)增的平臺(tái)期擴(kuò)增的平臺(tái)期分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.2.4 實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)技術(shù)實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)技術(shù)通過(guò)技術(shù)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為產(chǎn)物堆積

42、對(duì)定量分析的干擾，亦被稱為定量定量PCR。2020世紀(jì)世紀(jì)9090年代末期出現(xiàn)。年代末期出現(xiàn)。 分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCRPCR PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，引入一種熒光化學(xué)物質(zhì)，對(duì)每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè) 可以得到熒光擴(kuò)增曲線 實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量和定性分析5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上兩種定量化學(xué)兩種定量化學(xué)5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上熒光染料染色熒光染料染色 SYBR Green I 是一種是一種DNA小溝結(jié)合染料小溝結(jié)合染料與與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)光雙

43、鏈結(jié)合時(shí)發(fā)光游離時(shí)不發(fā)光游離時(shí)不發(fā)光5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 PCR過(guò)程中熒光染料的摻入：信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈過(guò)程中熒光染料的摻入：信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA分子數(shù)正比。激發(fā)光波長(zhǎng)分子數(shù)正比。激發(fā)光波長(zhǎng)520nm。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上染料的特點(diǎn)染料的特點(diǎn)5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 Taqman探針探針一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列擴(kuò)增有關(guān)。探針5端連接熒光(報(bào)告)基團(tuán)，3端連接淬滅基團(tuán)。PCR延伸反應(yīng)時(shí)，利用DNA聚合酶的5 3外切酶活性

44、，使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光信號(hào)。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5端連接熒光基團(tuán)端連接熒光基團(tuán)中段特異堿基序列（中段特異堿基序列（50-150bp）3端連接淬滅基團(tuán)端連接淬滅基團(tuán)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的信號(hào)強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNADNA分子數(shù)成正比分子數(shù)成正比5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)n 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理技術(shù)原理分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上n 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游引物上游引物下游引下游引物物熒光標(biāo)記引物熒光標(biāo)記引物RQ 33555.2 DNA基本操作技術(shù)基本

45、操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 分子信標(biāo)分子信標(biāo) TaqManTaqMan探針的衍生物探針的衍生物 發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩端分別連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩端分別連接熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。利用分子構(gòu)象的改變使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開利用分子構(gòu)象的改變使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上探針的特點(diǎn)探針的特點(diǎn)5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上方法方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)適用范圍適用范圍

46、SYBR SYBR Green I Green I 方法方法適用性廣適用性廣靈敏靈敏方便方便便宜便宜引物要求高引物要求高易出現(xiàn)非特異性易出現(xiàn)非特異性帶帶不能進(jìn)行多重定不能進(jìn)行多重定量量適合科研中對(duì)各種目適合科研中對(duì)各種目的基因定量分析，基的基因定量分析，基因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)因表達(dá)量的研究，轉(zhuǎn)基因重組動(dòng)植物的研基因重組動(dòng)植物的研究究TaqMan TaqMan 方法方法特異性高特異性高重復(fù)性好重復(fù)性好多重定量多重定量?jī)r(jià)格高價(jià)格高只適合特定目標(biāo)只適合特定目標(biāo)病原體檢測(cè)，疾病耐病原體檢測(cè)，疾病耐藥基因研究藥基因研究, ,藥物療藥物療效考核效考核遺傳疾病的診斷遺傳疾病的診斷不同實(shí)時(shí)定量方法的比較不同實(shí)時(shí)

47、定量方法的比較5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù) (genomic DNA library) cDNA文庫(kù)文庫(kù)(cDNA library) n 基因文庫(kù)基因文庫(kù)(gene library)是指一個(gè)包含了某一生物體全部是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNADNA序列的克隆群體。序列的克隆群體。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.2.5 基因組基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建文庫(kù)構(gòu)建分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上基因組基因組DNA文庫(kù)文庫(kù)基因組基因組DNADNA文庫(kù)是指生物的文庫(kù)是指生物的基因組基因組DNA的信息（包括所有的編

48、碼區(qū)和非編的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有用于構(gòu)建基因組文庫(kù)的載體有 噬菌噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。體、粘粒和酵母人工染色體等。5.2 DNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上n基因組文庫(kù)和基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和篩選文庫(kù)的構(gòu)建和篩選體外包裝體外包裝噬菌體噬菌體分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.3.1 總總RNA的提取的提取5.3.2 mRNA的純化的純化5.3.3 cDNA的合成的合成5.3.4 cDNA文

49、庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建5.3.5 基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.3.1 總總RNA的提取的提取 RNA易遭降解，實(shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格?？傄自饨到猓瑢?shí)驗(yàn)要求較嚴(yán)格?？俁NA提取的方法有多提取的方法有多種，主要有種，主要有LiCl法法、CTAB法法、異硫氰酸胍法異硫氰酸胍法（TriZol）。）。 異硫氰酸胍法異硫氰酸胍法（TriZol）原理：）原理： TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使

50、RNA與蛋白與蛋白質(zhì)分離，并將質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無(wú)色）主要為分離開。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層，有機(jī)層（黃色）主要為（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。和蛋白質(zhì)。收集含有收集含有RNA的水相，通過(guò)異丙醇沉淀，可獲得比較純的總的水相，通過(guò)異丙醇沉淀，可獲得比較純的總RNA。分子生物學(xué)研究方法上分子生物

51、學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 DNA或或RNA的定量的定量OD260=1.0相當(dāng)于相當(dāng)于50 g/ml 雙鏈雙鏈DNA40g/ml RNA33g/ml 單鏈單鏈DNA 判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度DNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8RNA純品純品: OD260/OD280 = 1.8-2.0u OD260的應(yīng)用的應(yīng)用分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.3.2 mRNA的純化的純化5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法

52、。法最為有效，已成為常規(guī)方法。 利用利用mRNA的的Poly A結(jié)構(gòu)，試劑盒提供一種生物素化寡聚結(jié)構(gòu)，試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物，與引物，與Poly A雜交，形成生物素化寡聚雜交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜的雜交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用，形成抗交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結(jié)合作用，形成抗生物素生物素-順磁顆粒（順磁顆粒（SA-PMPs）結(jié)合雜交體，形成生物素化）結(jié)合雜交體，形成生物素化寡聚寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復(fù)合物，再利用磁性吸附作用以復(fù)合物，再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復(fù)合物中的磁性條吸附復(fù)合物中的SA-PMPs顆粒，最后利用高嚴(yán)緊度

53、顆粒，最后利用高嚴(yán)緊度鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚dT引物與引物與mRNA分離，從而純化得到分離，從而純化得到mRNA。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2022-1-3185PolyATtract mRNA的分的分離純化過(guò)程離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖簡(jiǎn)圖5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.3.3 cDNA的合成的合成5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù) cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。的合成。 第一鏈第一鏈cDNA的合成是以的合成是以mRNA為

54、模板，反轉(zhuǎn)錄為為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引物是物是oligo dT。 第二鏈合成是以第一鏈為模板，由第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。聚合酶催化。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部定條件下所表達(dá)的全部mRNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息?；虮磉_(dá)信息。 5.3 RNA

55、基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)5.3.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建文庫(kù)的構(gòu)建分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上 cDNA文庫(kù)文庫(kù)(complementary DNA library)以以組織細(xì)胞中的組織細(xì)胞中的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成為模板，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈雙鏈cDNA ，各，各cDNA分子分別插入載體形分子分別插入載體形成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這成重組子，再導(dǎo)入宿主細(xì)胞克隆擴(kuò)增。這些在重組體內(nèi)的些在重組體內(nèi)的cDNA的集合即的集合即cDNA文庫(kù)。文庫(kù)。5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)l cDNA文庫(kù)構(gòu)建基本程序：文庫(kù)構(gòu)建基本程序：分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上構(gòu)建步驟：構(gòu)

56、建步驟： 1、高質(zhì)量mRNA制備：純化試劑盒，生物素 2、反轉(zhuǎn)錄生成cDNA: 反轉(zhuǎn)錄酶，olig(dt) ,R6 3、與噬菌體載體分子連接 4、噬菌體的包裝5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶cDNA復(fù)制雙雙鏈鏈c cD DN NA A載體重重組組D DN NA A分分子子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上2022-1-3192 基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)基因文庫(kù)的篩選是指

57、通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出含有所需重組中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程分子的特定克隆的過(guò)程。 篩選方法有很多種，常用的有：篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法：廣泛的適用性和快速性。核酸雜交法：廣泛的適用性和快速性。PCR篩選法：前提是獲得基因的特異性引物。篩選法：前提是獲得基因的特異性引物。免疫篩選法：適用于表達(dá)文庫(kù)的篩選。免疫篩選法：適用于表達(dá)文庫(kù)的篩選。5.3.5 基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上DNADNA探針探針：帶有特殊堿基帶有特殊堿基序列的單鏈序列的單鏈DNADNA或或RNARNA分

58、子分子, ,可可以用放射性物以用放射性物質(zhì)或免疫性物質(zhì)或免疫性物質(zhì)標(biāo)記質(zhì)標(biāo)記, ,通過(guò)雜通過(guò)雜交交, ,檢查樣品。檢查樣品。DNADNA探針探針常用于常用于檢測(cè)互補(bǔ)的堿檢測(cè)互補(bǔ)的堿基序列。基序列。 5.3 RNA基本操作技術(shù)基本操作技術(shù)分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用5.4.1 SNP概述概述5.4.2 SNP的檢測(cè)技術(shù)的檢測(cè)技術(shù)5.4.3 SNP的應(yīng)用的應(yīng)用分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上5.4.1 SNP概述概述 SNP（single nucleotide polymorphism）即單）即單核苷酸多態(tài)性，指基因組核苷酸多態(tài)性，指基因組

59、DNA序列中由于單序列中由于單個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。個(gè)核苷酸的突變而引起的多態(tài)性。 在人類基因組發(fā)生的頻率可達(dá)在人類基因組發(fā)生的頻率可達(dá)1%或更高?；蚋摺?每每300-1000個(gè)個(gè)bp就有一個(gè)就有一個(gè)SNP。 一個(gè)一個(gè)SNP表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核表示在基因組某個(gè)位點(diǎn)上有一個(gè)核苷酸的變化，源于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換苷酸的變化，源于單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或顛換5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用 分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上SNP分類：分類：5.4 SNP的理論與應(yīng)用的理論與應(yīng)用 1、根據(jù)、根據(jù)SNP在基因組的位置分三種：在基因組的位置分三種： 基因編碼區(qū)基因編碼區(qū)SNP：變

60、異率較少，占：變異率較少，占1/5。 基因調(diào)控區(qū)基因調(diào)控區(qū)SNP：會(huì)影響基因表達(dá)量的多少。：會(huì)影響基因表達(dá)量的多少。 基因間隨機(jī)非編碼區(qū)基因間隨機(jī)非編碼區(qū)SNP2、根據(jù)對(duì)生物遺傳性狀的影響分兩類：、根據(jù)對(duì)生物遺傳性狀的影響分兩類： 同義同義SNP：不影響氨基酸的翻譯。：不影響氨基酸的翻譯。 非同義非同義SNP：改變氨基酸序列，影響蛋白質(zhì)功能。：改變氨基酸序列，影響蛋白質(zhì)功能。分子生物學(xué)研究方法上分子生物學(xué)研究方法上u SNPs SNPs的研究意義的研究意義SNPsSNPs作為第三代作為第三代遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記（已知性、可（已知性、可遺傳性、可檢測(cè)性），用于疾病基因的遺傳性、可檢測(cè)性），用于疾病基