高效液相色譜法測定注射用磷酸依托泊苷的含量及有關(guān)物質(zhì)

1、    高效液相色譜法測定注射用磷酸依托泊苷的含量及有關(guān)物質(zhì)        摘要目的：測定注射用磷酸依托泊苷的含量及有關(guān)物質(zhì)。方法：采用高效液相色譜法，用 BondpakTM Phenyl柱，流動相為乙腈-0.02mol.L-1磷酸二氫銨溶液(2278)，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5，檢測波長為230nm。結(jié)果：磷酸依托泊苷在0.049200.4428mg.ml-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好(r=0.9999,n=5);平均回收率為99.8%，檢測限為2.5ng。有關(guān)物質(zhì)依托泊苷

2、和木酚素P磷酸酯的最低檢測限分別為2.4，0.45ng。結(jié)論：方法簡便、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。關(guān)鍵詞高效液相色譜法；磷酸依托泊苷；含量測定Determination of etoposide phosphate and related substance by HPLCPeng Xingsheng (Peng XS) (Shanghai Institute for Drug Control,Shanghai200233)ABSTRACTOBJECTIVE:To develop a determination method of etoposide phosphate and related s

3、ubstance.METHODS:A BondpakTM Phenyl Column (3.9mm×300mm,10m,Waters) was used.The mobile phase consisted of acetonitrile -0.02mol.L-1 ammonium dihydrogen phosphate solution (2278) with the pH adjusted to 2.5 with phosphoric acid.Detection was performed with UV detector at 230nm.RESULTS:The calib

4、ration curve for etoposide phosphate was linear within the concentration range of 0.049200.4428mg.ml-1(r=0.9999,n=5).The average recovery was 99.8%.The limits of detection for etoposide phosphate,etoposide and lignan P phosphate were 2.5,2.4 and 0.45ng,respectively.CONCLUSION:The method had the adva

5、ntages of simplicity,rapidity,accuracy and precision.KEYWORDSHPLC,etoposide phosphate,assay注射用磷酸依托泊苷是Bristol-Myers Squibb公司的新產(chǎn)品，屬抗腫瘤藥，是由磷酸依托泊苷和右施糖酐40，枸櫞酸鈉等賦形劑制成的無菌凍干品，在生產(chǎn)及貯存過程中可能產(chǎn)生依托泊苷、木酚素P磷酸酯、-依托泊苷、木酚素P和4?-去甲基表鬼臼素等雜質(zhì)。本實驗采用高效液相色譜法對其主要成分含量及其可能存在的一些雜質(zhì)進行了檢測，并對溶液穩(wěn)定性進行了考查。1儀器與試劑Shimadzu CLASS LC-10A型高效液相

6、色譜儀，LC-10AD泵，SPD-10A檢測器，SIL-10A自動進樣器。磷酸依托泊苷(Etoposide Phos)，依托泊苷(Etop)，木酚素P磷酸酯(Lignan P Phos),-依托泊苷(-Etop)，木酚素P(Lig P)和4-去甲基表鬼臼素(DMEP)均由美國Bristol-Myers Squibb公司提供。乙腈(HPLC)，磷酸二氫銨(AR)，磷酸(AR)。2 方法與結(jié)果2.1色譜條件 BondpakTM Phenyl柱(3.9mm×300mm,10m,Waters)，以乙腈-0.02mol.L-1磷酸二氫銨溶液(22：78)并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5為流動相，流速

7、1.5ml*min-1,檢測波長230nm，進樣量20l。2.2對照品溶液的配制2.2.1磷酸依托泊苷對照品溶液取磷酸依托泊苷對照品適量，用流動相溶解并定量稀釋制成每1ml約含200g的溶液，即得。2.2.2 木酚素P磷酸酯對照品溶液取木酚素P磷酸酯對照品適量，用流動相溶解并定量稀釋制成每1ml約含5g的溶液，即得。2.2.3 依托泊苷對照品溶液取依托泊苷對照品約12mg，精密稱定，置250ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取2ml置20ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取磷酸依托泊苷對照品約100mg置100ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻

8、，作為對照儲備液。精密量取貯備液1，3，5，7，和9ml，分別置5只20ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。取20l分別注入色譜儀，記錄色譜，磷酸依托泊苷在0.049200.4428mg.ml-1濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度(mg.ml-1)呈良好線形關(guān)系，回歸方程為y=29977.1+19838827.2x，相關(guān)系數(shù)r=0.9999 (n=5)。2.4精密度實驗分別取磷酸依托泊苷對照品溶液，木酚素P磷酸酯對照品溶液和依托泊苷對照品溶液重復(fù)進樣5次進行精密度試驗，RSD分別為0.11，0.86和0.96%。2.5最低檢測限測定2.5.1 木酚素P磷酸酯最低檢測限測定取木酚素P磷酸酯對照品適量，用流

9、動相溶解并定量稀釋成0.4508g.ml-1的溶液，分別取1，2，5，10，20l分別注入液相色譜儀進行測定，測得最低檢測限為0.4508ng (S/N=31)。2.5.2 依托泊苷最低檢測限測定取依托泊苷對照品約12mg，精密稱定，置250ml量瓶中，用乙腈溶解并稀釋到刻度，搖勻。精密量取2ml置200ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。分別取2，5，10，20l注入液相色譜儀進行測定，測得最低檢測限為2.406ng (S/N=31)。2.6 樣品測定取供試品1瓶，用流動相定量轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml置25ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

10、取20l注入液相色譜儀，記錄色譜，至主成分峰保留時間的8倍，按外標(biāo)法以峰面積分別計算磷酸依托泊苷的含量及兩種已知相關(guān)雜質(zhì)，即木酚素P磷酸酯及依托泊苷的量，并用歸一化法計算其它雜質(zhì)的量，結(jié)果見表1，表2。表1注射用磷酸依托泊苷含量和有關(guān)雜質(zhì)量.%，n3EtoposideLignan PEtopLig P-EtopDMEP其它雜雜質(zhì)PhosPhos質(zhì)總和總和98.40.821.970.036未檢出未檢出0.233.02103.51.041.900.036未檢出未檢出0.233.17106.01.141.560.033未檢出未檢出0.242.94表2磷酸依托泊苷和有關(guān)雜質(zhì)的保留時間.min名稱保留時

11、間名稱保留時間磷酸依托泊苷4.643木酚素6.53木酚素P磷酸酯2.354-依托泊苷28.96依托泊苷24.694?-去甲基表鬼臼素14.12.7 溶液穩(wěn)定性考查對供試品溶液進行了017h的穩(wěn)定性考察，主要雜質(zhì)依托泊苷的量在1.9%2.0%之間隨時間變化增加不明顯，木酚素P磷酸酯的量在0.83%2.2%之間隨時間變化逐漸增加，未知雜質(zhì)中峰(tR=3.8min)由0.08%增加至0.44%，隨時間變化逐步增加，其它雜質(zhì)總和在17h內(nèi)由0.22%增至0.57%，總雜質(zhì)由2.9%增至4.7%。為使測定結(jié)果正確，有關(guān)雜質(zhì)測定時供試品溶液最好新鮮配制(至少配制后在4h內(nèi)應(yīng)用)，含量測定時供試品溶液也至少

12、應(yīng)在配制后16h內(nèi)進行分析，否則會使含量結(jié)果偏低。 3 討論3.1乙腈比例變化對色譜的影響選用乙腈-0.02mol/L磷酸二氫銨溶液(1585)并用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5的溶液為流動相時，出峰時間過長，雜質(zhì)依托泊苷2h內(nèi)仍不出峰，且峰形嚴(yán)重擴散，增加流動相中乙腈的比例能顯著改變雜質(zhì)依托泊苷的峰型，乙腈比例從15%增至22%時出峰時間從2個多小時變?yōu)?4min，增加乙腈比例雖也能改變主峰磷酸依托泊苷及其它雜質(zhì)的保留時間，但變化不如依托泊苷峰明顯。經(jīng)試驗，調(diào)節(jié)乙腈-0.02mol/L磷酸二氫銨溶液比例至2278時，色譜系統(tǒng)中主峰及各雜質(zhì)峰分離效果最佳，磷酸依托泊苷與木酚素P磷酸酯的分離度達9.0，且雜質(zhì)依托泊苷能在30min內(nèi)出峰。3.2流動相pH值對色譜的影響降低流動相pH值能增加各峰在色譜柱上的保留，從而改善分離，但對雜質(zhì)依托泊苷