細菌總DNA(total DNA, genomic DNA)提取和凝膠電泳檢測

1、細菌總 DNA (total DNA, genomic DNA提取和凝膠電泳檢測總 DNA (total DNA, genomic DNA凝膠電泳1. 學習細菌總 DNA 提取的原理和方法2. 學習瓊脂糖凝膠電泳方法關鍵詞:電泳凝膠細菌細菌總 DNAtotalDNAgenomic 提取凝膠電 泳基本概念:總 DNA (total DNA, genomic DNA凝膠電泳實驗目的 1. 學習細菌總 DNA 提取的原理和方法2. 學習瓊脂糖凝膠電泳方法實驗材料 1. 菌種自己分離純化后的細菌菌株2. 試劑TE 、溶菌酶溶液(20mg/ml 、 10% SDS 、蛋白酶 K (20mg/ml 、 5

2、mol/L NaCl 酚 :氯仿 :異戊醇 (25:24:1、乙醇3. 儀器高速臺式離心機、紫外檢測儀4. 其他材料:離心管、無菌吸頭、移液器等實驗步驟和過程 (一細菌總 DNAD 提取革蘭氏陽性菌 DNA 提取方法 (提取基因組 DNA1. 3-6ml 細菌過夜培養(yǎng)液 , 5000rpm離心 10分鐘 , 棄上清2. 加 0.5ml TE懸浮沉淀 , 并加 75l 溶菌酶(20mg/ml溶液, 40°C 保溫 30分鐘3. 加 50l, 10% SDS, 5l 蛋白酶 K (20mg/ml , 混勻 , 37保溫 30分鐘4. 加 0.75ml, 5mol/L NaCl, 混勻5.

3、 用等體積酚 :氯仿 :異戊醇 (25:24:1抽提 , 5000rpm離心 10分鐘 , 將上清液移至干凈離 心管6. 用等體積氯仿 :異戊醇 (24:1抽提 , 靜置 10分鐘, 5000轉離心 10分鐘,轉移上清到干 凈管中。7. 加 2倍體積乙醇沉淀 DNA, 顛倒混合 , 室溫下靜止 10分鐘,離心沉淀 DNA8. 70%乙醇漂洗 DNA 后 , 吸干 , 用 30-50l TE溶解 DNA, -20保存革蘭氏陰性菌總 DNA 提取方法方法一:1. 將菌液懸于 1.5ml 溶菌酶溶液(0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶, pH=8

4、 .2. 37溫浴 2h ,3. 加入 1.5ml 10%SDS(0.1mol/l Nacl , 0.5mol/l Tris , 10%SDS, pH=8 反復顛倒混勻 10min , 10000r/min離心 10min ,取上清4. 用等體積苯酚:氯仿:異戊醇各抽提 1次,水相中加入 40l 的 3mol/l乙酸銨和 3ml 無水乙醇, -20沉淀 DNA1h , 12000r/min 離心 10min5. 收集 DNA 沉淀,用 100l TE溶解方法二:1. 加入 DNA 提取液 100 mmol/l, (Tris100 mmol/lEDTA, 100 mmol/lNacl, 1%pv

5、p , 2%SDS, pH=8旋渦混勻2. 在搖床上 250 r/min振蕩 2h , 4沉淀 DNA 1 h, 13000 r/min離心 10min 收集 DNA 沉淀3. 用 100lTE 溶解 DNA方法三:1. 加入 DNA 提取液 (100 mmol/l, Tris100 mmol/lEDTA, 100 mmol/l磷酸鈉, 1.5mol/l Nacl , 1%CTAB, pH=8 , 20l 蛋白酶 K (20mg/ml和 500l 溶菌酶(0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶, pH=8 , 37溫浴 2h 。2. 加入 1 m

6、l 20%SDS, 65水浴過夜3. 加入 1/3倍體積飽和 Nacl, 劇烈振蕩, 12000 r/min 離心 10min4. 取上清,用等體積苯酚:氯仿:異戊醇各抽提 1次,水相中加入等體積 TE ,再加入 0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀 DNA 2h5.12000 r/min 離心 10min 收集 DNA 沉淀,用 200lTE 溶解細菌 DNA 提取如果是革蘭氏陰性菌可采用以下方法(熱烈解法 :(1細菌過夜振蕩培養(yǎng),(2離心取菌體,(3 500L 滅菌雙蒸水洗一次,(4離心取菌體,(5用適量滅菌水(視菌體濃度,通常 70200L 重懸,(6 100水浴 10min ,置于冰上 5mi

7、n ,(7 1300rpm 離心 510min,(8取上清,即為總 DNA , 4或 -20保存。下面方法適用于革蘭氏陽性和陰性菌(1菌體培養(yǎng),獲得足夠的菌體,(2菌體收集,(3輔助裂解:如果是 G+菌,應先加溶菌酶 100g/mL 50L 。 37處理 1h 。(4裂解:向每管加入 200L 裂解緩沖液 緩沖液含 (終濃度 40mmoL/L Tris-HCl, pH8.0 20mmol/L乙酸鈉, 1mmol/L EDTA , 1%SDS ,用吸管頭迅速強烈抽吸以懸浮和裂解細菌細胞; (5接著向每管加入 66L 5mol/L NaCl,充分混勻后, 12 000r/min離心 10min ,

8、除去蛋白 質復合物及細胞壁等殘渣;將上清轉移到新離心管中,加入等體積的用 Tris 飽和的苯酚,充分混勻后, 12 000r/min離心 3min ,進一步沉淀蛋白質;(7取離心后的水層,加等體積的氯仿,充分混勻后, 12 000r/min離心 3min, 去除苯酚。 小心取出上清用預冷兩倍體積的無水乙醇沉淀, 15 000r/min 高速離心 15min ,離心棄上清 液。(9用 400L 70%的乙醇洗滌兩次。(10(真空干燥后,用 50LTE 或超純水溶解 DNA , -20冰箱放置備用。還有方法適用于革蘭氏陽性和陰性菌(飽和酚法(1收集細菌培養(yǎng)物,加入 565L 的 TE 緩沖液,輕輕

9、吹打使重懸,(2加 30L 的 10% SDS和 20mg/ml的蛋白酶 K ,混勻, 37孵育 3h 以上或過夜,(3將溶液冷卻至室溫,加入等體積的(600L 飽和酚,緩慢來回顛倒離心管 10min , 以小心混合, 13000min 離心 5min 以上,(4取上清至另一管中,再加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1 ,離心,(5取上清至另一管,加入 1/10體積的 pH5.0 3M的 NaAC 和 2倍體積的無水乙醇,混勻, -20 15min 以上,再離心 12000rpm 15min,(6純點用 75%乙醇洗一次,去上清,干燥,(7加入 50L 的 pH8.0的 TE 緩沖液, -20保

10、存。細菌總 DNA 的提取和鑒定點擊次數(shù):130 發(fā)表于:2008-07-08 17:32 轉載請注明來自 *來源:互聯(lián)網(wǎng)【目的和要求】1. 學會 CTAB 法提取細菌總 DNA 。2. 掌握 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳法?！緦嶒炘怼緿NA 在生物體內是與蛋白質形成復合物的形式存在的,因此提取出脫氧核糖核蛋白復合物 后,必須將其中蛋白質去除。 CTAB (溴代十六烷基三甲胺是一種去污劑,它能與核酸形成 復合物,在高鹽溶液中可溶并且穩(wěn)定存在,若降低鹽濃度, CTAB 與核酸的復合物會沉淀出 來,而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。DNA 的電泳原理與蛋白質的電泳原理基本相同。 DNA 分子在高于其等

11、電點的 pH 溶液中帶負電 荷, 在電場中向正極移動。 由于 DNA 分子或 DNA 片斷的分子量差別, 電泳后呈現(xiàn)遷移位置的 差異。【實驗試劑和器材】(一試劑:菌株(E.coli ;蛋白酶 K (20mg/ml ;瓊脂糖;標準 DNA 水解液1.10%SDS2.酚 /氯仿 /異戊醇(1/1/13. 異丙醇; 70%乙醇4. LB 培養(yǎng)基:蛋白胨 10g, 酵母粉 5g,NaCl 10g加蒸餾水至 1升,然后滅菌備用。5. TE 緩沖液:10mM Tris HCl,0.1mM EDTA (pH8.0。6. CTAB/NaCl溶液 (5% w/v:5g CTAB 溶于 100ml 0.5M Na

12、Cl溶液中,需要加熱到 65使 之溶解,然后室溫保存。7. TAE 緩沖液 (50× (pH8.0:每升溶液中含有 242g Tris,57.1ml 冰乙酸, 100ml 0.5mol/L EDTA 。電泳時稀釋成 1×濃度使用。8.溴酚蘭 -甘油指示劑:先配制 0.1%溴酚蘭水溶液,然后取 1份 0.1%溴酚蘭溶液與等體積 的甘油混合即成9. 0.5g/ml 溴乙啶染液:稱取 5mg 溴乙啶,用重蒸水溶解定容到 10ml, 取 1ml 此溶液用 1xTAE 緩沖液稀釋到 1升,最終濃度為 0.5g/ml。(二器材:錐形瓶(250ml , 1.5ml 離心管,水浴鍋,離心機

13、,電泳槽,電泳儀,搖床,移液槍,潔凈 工作臺,電磁爐,紫外成像儀【實驗方法】(一細菌總 DNA 的提取1. 將菌株接種于液體 LB 培養(yǎng)基, 37震蕩培養(yǎng)過夜。2. 取 1.5ml 培養(yǎng)物 12000rpm 離心 2min 。3. 沉淀物加入 567l 的 TE 緩沖液,反復吹打使之重新懸浮,加入 30l 10%SDS和 15l 的蛋白酶 K ,混勻,于 37溫育 1h.4. 加入 100l 5mol/L NaCl, 充分混勻,再加入 80l CTAB/NaCl溶液,混勻后再 65溫育5. 加入等體積的酚 /氯仿 /異戊醇混勻,離心 4-5min, 將上清轉入一只新管中,加入 0.6-0.8倍

14、體積的異丙醇,輕輕混合直到 DNA 沉淀下來,沉淀可稍加離心。6. 沉淀用 1ml 的 70%乙醇洗滌后,離心棄乙醇,在潔凈工作臺中稍加干燥,重溶于 20l TE 緩沖液 (含 RNaseA-25ng/ml中,準備電泳檢測。(二瓊脂糖凝膠電泳1. 制膠:稱取瓊脂糖粉末,置于三角瓶中,加入 TAE 緩沖液配成 0.8%的濃度,加熱使瓊脂 糖全部融化于緩沖液中,待溶液溫度降至 65時,立即倒入制膠槽中,插入樣品梳。在室 溫放置 0.5-1h ,待凝膠全部凝結后,輕輕拔出樣品梳。然后在電泳槽中加入電泳緩沖液直 到沒過凝膠為止。2. 加樣:取 0.5-1g 左右的樣品, 體積為 10-20l , 加入

15、 1/4體積的溴酚蘭 -甘油指示劑, 混勻后小心地加到樣品槽中。 同時另取一個已知分子量的標準 DNA 水解液, 在同一凝膠板上 進行電泳。3. 電泳:維持恒壓 100V ,電泳 0.5-1h ,直到溴酚蘭指示劑移動到凝膠底部,停止電泳。4. 染色:將凝膠取出后浸入 0.5mg/ml 溴乙啶溶液中,染色 0.5-1h 。染液可反復多次使用。5. 觀察:將凝膠板置于 254nm 波長紫外燈下進行觀察。 DNA 存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光?！咀⒁馐马棥?. 溴乙啶有毒, 配制和使用溶液時要戴手套, 勿將溶液滴灑在臺面或地面上。 溴乙啶溶液于 室溫保存在棕色瓶中。2. 倒凝膠板時不要太厚, 否則影響電

16、泳效果。 謝謝各位戰(zhàn)友了!您好, 請問滅菌水的是什么 啊?去離子水或者蒸餾水 121度滅菌細菌 DNA 提取方案細菌 DNA 提取方案:革蘭氏陰性菌,如 E.coli ,一般有三種可以選擇的方法。一、水煮模板法主要用于 PCR 反應1、接種單菌落于 LB 或腦心平板,連續(xù)畫線, 37攝氏度培養(yǎng) 18-24小時。2、刮取 12接種環(huán)菌苔加入 150微升三蒸水中,混勻, 100攝氏度煮沸 10分鐘。3、 12000轉 /分鐘 離心 10分鐘,取上清,-20攝氏度保存?zhèn)溆?。操作最簡?對試劑條件要求低。缺點是純度不夠高,可能會含有 RNA 、蛋白等雜質。但是 作為一般檢測目的的 PCR 反應模板已經

17、足夠了。有人稱擴增 4kb 以下片段都可用此種方法制取模版, 編者用此類模板 PCR 可以擴增到 3500bp 的片段。編者建議:此法得到的模版保存時間短,強烈建議每月重新制作一次。二、 CTAB/NaCl 法1、接種一單菌落于 5mlLB 中 ,30培養(yǎng)過夜 ,2、取 1ml 種子培養(yǎng)液接入 100ml2%LB中 ,37、 220r/min培養(yǎng) 16小時 ;3、 5000r/min離心 10分鐘 , 棄去上清。4、加入 10mlTE 離心洗滌后 , 用 10mlTE 溶解菌體 , 混勻 ,-20保存?zhèn)溆谩?、取 3.5ml 菌懸液 , 加入 184l10%SDS,混勻 , 加入 37l10m

18、g/ml蛋白酶 K, 混勻 ,37溫育 1小時6、加入 740l5mol/LNaCl,再加入 512lCTAB/NaCl,混勻 ,65溫育 10分鐘。7、加入等體積的氯仿 /異戊醇 , 混勻 ,10000r/min離心 5分鐘 , 保留上清。8、 上清中加入等體積的酚氯仿異戊醇 (25 24 1, 混勻 ,10000r/min離心 5分鐘 , 保留9、加入 0.6倍的異丙醇 , 混勻 ,10000r/min離心 5分鐘 , 收集 DNA 沉淀 , 用 70%乙醇離心洗滌 DNA 沉淀。10、用 1mlTE 溶解 DNA, 加入終濃度為 20g/mlRNaseA,4保存。CTAB/NaCl法提取的 DNA 純度較高, 蛋白雜質較少, 保存時間長, 編者更喜歡把終濃度為 20g/ml RnaseA 加在第 5步溫育的時候,這樣最后沒有 RnaseA 污染。每一步操作細致一些, 得到的 DNA 可用