光動(dòng)力治療人膽管癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究

1、光動(dòng)力治療人膽管癌細(xì)胞荷瘤裸鼠的實(shí)驗(yàn)研究         08-07-22 10:35:00     編輯：studa20           作者：邵志堅(jiān)薛平盧海武張長(zhǎng)丹      【摘要】  目的 研究光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT) 對(duì)人膽管癌荷瘤裸鼠的治療效果，探討其抗腫瘤性、安全

2、性及腹腔注射和瘤內(nèi)注射光敏劑兩種不同給藥途徑療效的差異。方法 人膽管癌細(xì)胞QBC939接種于Balb/c裸小鼠皮下，建立荷瘤動(dòng)物模型。以血卟啉衍生物（HpD）作光敏劑，采用腹腔內(nèi)和瘤內(nèi)注射2種不同給藥方式，后以波長(zhǎng)630 nm的激光照射腫瘤組織，觀察PDT后腫瘤體積變化和病理改變。結(jié)果 接受光動(dòng)力治療的兩組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢，瘤內(nèi)局部注射給藥組療效與腹腔給藥組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;組織學(xué)檢查見腫瘤組織有廣泛壞死，各組裸鼠心、肝、肺、腎組織切片未見病理性結(jié)構(gòu)改變。結(jié)論 HpD，PDT對(duì)人膽管癌荷瘤裸鼠的腫瘤組織有殺傷作用，使腫瘤生長(zhǎng)減慢； HpD-PDT殺傷膽管癌移植瘤的深度

3、可達(dá)0.8 cm；在本實(shí)驗(yàn)光照條件下的PDT治療是安全的。 【關(guān)鍵詞】  膽管腫瘤；光動(dòng)力治療；血卟淋衍生物；鼠Experimental study of photodynamic therapy on cholangiocarcinoma in a nude mice model        Abstract  Objective To investigate the therapeutic effect and safety of photodynamic therapy (PDT) on chol

4、angiocarcinoma in a nude mice model，and to evaluate the difference of anti-tumor, therapeutic effect with different routes of giving drug HpD given ways： intraperitoneal injection and intratumoral injection. Methods  The animal model of carrying human cholangiocarcinoma was established by inocu

5、lating human QBC939 cells  into the dorsum of nude mice. The photosensitizer hematoporphyrin derivative (HpD) was given by two different ways： intraperitoneal injection and intratumoral injection. 630 nm He-Ne laser was used to irradiate the tumor after injection. The tumor volume was measured，

6、 and its morphologic changes were studied. Results  The tumor growth was significantly reduced after PDT， there was no difference between the intratumoral injection group and  the intraperitoneal injection one. All groups showed normal in the sections of heart, liver, lung and kidney. Conc

7、lusion  HpD-PDT has the killing and damaging effect on cholangiocarcinoma. In comparison with the HpD injection way， intratumoral injection is as efficient as intraperitoneal injection（P0.05）; HpD-PDT execution transplantation depth may reach 0.8 cm； and made the growth volume of the tumor decr

8、ease. It is safe for PDT in this illumination condition in the experiment.    Key words  bile duct neoplasms;  photodynamic therapy;hematoporphyrin derivative； rats膽管癌是起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，由于其解剖位置特殊，起病隱匿，確診時(shí)往往已到晚期，失去根治性切除機(jī)會(huì)，預(yù)后極差，而膽管癌對(duì)放療和化療均不敏感1-2，因此，有需要尋找一種新的療效確切而毒副作用低的治療方法。光動(dòng)力療法(

9、photodynamic therapy， PDT) 是一種正在廣泛開展中的治療惡性腫瘤的新技術(shù)，已廣泛用于治療食道癌、肺癌、頭頸部腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌，國(guó)外有少量PDT治療膽管癌的實(shí)驗(yàn)和臨床研究。本實(shí)驗(yàn)研究PDT對(duì)人膽管癌荷瘤裸鼠的治療效果，探討其抗腫瘤性、安全性及腹腔注射和瘤內(nèi)注射光敏劑HpD兩種不同給藥途徑療效的差異，為臨床治療應(yīng)用提供相關(guān)參數(shù)。    1  材料和方法    11  儀器與試劑  He-Ne激光機(jī)：LD-PDT-O2型半導(dǎo)體激光治療機(jī)，波長(zhǎng)為630 nm。血卟啉衍生物（H

10、pD）注射液為重慶市華鼎現(xiàn)代生物制藥公司產(chǎn)品。QBC939人膽管癌細(xì)胞株由湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心提供。    12  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  Balb/c裸小鼠28只，4周齡，體質(zhì)量為1416 g，雌雄各半，SPF級(jí)，由中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供并飼養(yǎng)。    13  膽管癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立  QBC939人膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)于含10小牛血清的100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)瓶，置于恒溫37、5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中。每24 h更換一次培養(yǎng)液。23 d傳代

11、一次。當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞總數(shù)經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)5×107以上，以胰酶消化、離心收集各瓶細(xì)胞，以培養(yǎng)液稀釋制成1×107/ml的細(xì)胞懸液5 ml 。每只裸鼠于背部皮下注射濃度為1×107/ml的細(xì)胞懸液0.15 ml，接種后每2 d觀察動(dòng)物1次，約57 d可見注射部位皮下有黃褐色圓形或橢圓形結(jié)節(jié)樣腫物出現(xiàn)，隨時(shí)間推移腫物不斷增大，成瘤率為85.7。    14  動(dòng)物分組及PDT治療  成瘤后每3 d一次以游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄腫瘤的長(zhǎng)、短徑，約23周后取成瘤短徑0.6 cm以上的裸鼠20只，隨機(jī)分成4組，每組5只，A組：空白對(duì)照、不

12、作治療；B組：?jiǎn)渭兗す夤庹战M；C組：腹腔血卟啉注射+15 min激光光照；D組：腫瘤組織血卟啉注射+15 min激光光照。光動(dòng)力治療采用LD-PDT-O2型半導(dǎo)體激光治療機(jī)，激光波長(zhǎng)為30 nm，輸出功率為115 mW，照射距離：腫瘤上2 cm。照射時(shí)間為15 min，光斑直徑約1.5 cm。    1.4.1 麻醉  為保證裸鼠接受光照過(guò)程中光斑不移位，光照前20 min予每只按50 mg/kg腹腔注射3%的戊巴比妥進(jìn)行麻醉；取3%的戊巴比妥原液0.5 ml加入生理鹽水4.5 ml配成濃度為0.3%，按裸鼠體重用1ml注射器抽取0.30.4 ml注入腹

13、腔內(nèi)后局部壓迫一下。    1.4.2  腹腔內(nèi)注射光敏劑   血卟啉注射液遮光常溫溶解后按10 mg/kg注入腹腔，以無(wú)菌鋪巾遮蓋鼠籠盡量避光，48 h后接受光動(dòng)力治療。    1.4.3  腫瘤局部注射光敏劑  血卟啉按10 mg/kg分23點(diǎn)瘤內(nèi)注射，速度緩慢盡量避免光敏劑外溢至皮下，注射后2 h開始光照。    1.4.4  裸鼠接受光照  麻醉后裸鼠俯臥于臺(tái)上，遮光紙裁剪出腫瘤大小的洞覆蓋于鼠身上避免腫瘤以外部位接受光照。實(shí)驗(yàn)

14、者帶保護(hù)鏡觀察光照過(guò)程裸鼠有無(wú)移動(dòng)，必要時(shí)調(diào)整光斑位置。    1.5  腫瘤體積變化觀察  各組在光動(dòng)力治療后分別于第3，7，10，14天測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)短徑，按公式V=1/2長(zhǎng)徑×短徑2計(jì)算體積并作記錄。見表1，圖1。    1.6  標(biāo)本處理  光動(dòng)力治療后第14天處死各組裸鼠，完整切除皮下腫瘤，并切除取出裸鼠的心、肝、肺、腎各臟器，置于10%甲醛中固定，作病理切片，HE染色，常規(guī)光鏡檢查。    1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析。組間比較采用q檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為0.05。    2  結(jié)  果    2.1  光動(dòng)力治療后腫瘤形態(tài)及體積變化  空白組（A組）移植瘤持續(xù)生長(zhǎng)，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)表面未見自發(fā)性壞死，