一種高效可直接用于PCR擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組DNA的提取方法

1、生物技術(shù)通報研究報告年第期一種高效可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組的提取方法吳紅艷摘要：陳飛桓明輝關(guān)艷麗郭玲玲（遼寧省微生物科學(xué)研究院，沈陽）通過對提取不吸水鏈霉菌基因組的凍融法、微波法和溶菌酶破壁法等幾種方法進(jìn)行對比、分析，得出結(jié)論：溶菌酶破壁法所提取的不吸水鏈霉菌基因組可直接用于擴(kuò)增。這為今后不吸水鏈霉菌相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：不吸水鏈霉菌基因組提取擴(kuò)增（，）：，：不吸水鏈霉菌是由遼寧省微生物科學(xué)研究院在廣西梧州地區(qū)土樣中分離得到一株不吸水鏈霉菌（），其經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物為廣譜抗真菌抗生素（命名為梧寧霉素），對多種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制和殺死作用，而且其毒

2、性很低，具有廣闊開發(fā)應(yīng)用前景。但其一直存在著產(chǎn)量低、效價低、保存期短等問題，阻礙其廣泛的推廣應(yīng)用，這就需要找到一種改善的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，克隆不吸水鏈霉菌次級代謝過程中的激活因子和限速酶基因，增加其在菌種次級代謝中的表達(dá)，要對目的基因進(jìn)行表達(dá)，首要的任務(wù)就是基因組或的提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增、產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后與載體連接、轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)指標(biāo)的檢測等，因而其基因組或的獲得是前提條件。下面對于不吸水鏈霉菌基因組的提取方法進(jìn)行了研究探討。材料與方法材料菌種不吸水鏈霉菌菌種由遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種中心提供。裂解液、蛋白酶、無水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇

3、、亞精胺、試劑緩沖液、酶、等。水浴鍋、電泳儀、儀器高速冷凍離心機(jī)、儀等。方法不吸水鏈霉菌基因組提取。收稿日期：作者簡介：吳紅艷（），女，副研究員，研究方向：微生物及其分子生物學(xué)研究生物技術(shù)通報凍融法（一）提取基因組年第期（）菌種發(fā)酵用滅菌的接種針將不吸水鏈霉菌菌接種于培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，備用。（）菌體裂解取發(fā)酵液于離心，收集菌體，用緩沖液懸浮、洗滌，離心，收集菌體，加入緩沖液懸浮，再加入裂解液，混合均勻，再加入適宜濃度的蛋白酶，混合均勻，于水浴。（）基因組的提取取菌體裂解液離心收集上清液，加入無水乙醇、苯酚：氯仿：異戊醇混合液抽提，收集上層液，抽提兩次。按一定比例加入氯化鈉、異丙醇沉淀約，離心

4、收集沉淀。（）基因組的純化：步驟（）中收集到的沉淀加入混勻，再加入亞精胺沉淀，離心，收集沉淀，加入，以及異丙醇進(jìn)一步沉淀，離心，收集沉淀。（）用乙醇洗滌沉淀，離心，收集沉淀，揮干，將沉淀溶解于含酶的緩沖液中，水浴消化，保存。凍融法（二）提取基因組（）菌種發(fā)酵：用滅菌的接種針將不吸水鏈霉菌菌接種于培養(yǎng)液中，（）（）與凍融法提?。ㄒ唬┫嗤?，去掉步驟（），進(jìn)行步驟（）即得。微波法提取基因組振蕩培養(yǎng)，備用。（）基因組的提?。喝“l(fā)酵液于離心，收集菌體，加入洗滌液洗滌，在旋渦混合器上振蕩，離心，收集菌體，加入裂解液，振蕩懸浮，使溶液均勻，然后于功率為微波爐中處理；加入預(yù)熱的抽提液，振蕩；加入等體積的飽和酚

5、氯仿溶液抽提，離心，收集上清液，上清液以等體積的異丙醇沉淀，乙醇洗滌沉淀，離心，收集沉淀，干燥后溶解于含酶的緩沖液中，水浴消化，保存。溶菌酶破壁法提取基因組取培養(yǎng)的發(fā)酵液，離心，收集茵體，用（，）洗滌菌體，再用倍體積的含蔗糖的重懸菌體并加入溶菌酶，溫育；離心收集沉淀，用含蔗糖的懸浮沉淀，加入，室溫處理，再加入蛋白酶，溫育；加的和，溫育；然后用氯仿異戊醇（：）抽提二次，×體積異丙醇沉淀，收集沉淀，用乙醇洗滌，揮干，用溶解，保存?；蚪M瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品：（）凍融法（一）提取基因組；（）凍融法（二）提取的基因組；（）微波法提取的基因組；（）溶菌酶破壁法提取的基因組；（）為標(biāo)準(zhǔn)。瓊脂糖

6、凝膠濃度：電壓：電泳時間：。觀察：紫外燈觀察照相。以提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增經(jīng)研究表明在不吸水鏈霉菌的代謝過程中會產(chǎn)生膽固醇氧化酶，這種酶對鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目等害蟲都有毒殺作用，對鞘翅目的棉鈴蟲象甲具有極強(qiáng)的毒殺能力，是產(chǎn)生梧寧霉素的限速酶之一，因而，克隆膽固醇氧化酶基因是提高不吸水鏈霉菌梧寧霉素效價的重要途徑之一。模板：（）為凍融法（二）提取的基因組（）、（）、（）為溶菌酶破壁法提取的基因組（）為微波法提取的基因組引物：利用相關(guān)的分子生物學(xué)軟件，通過分析比較中已知的膽固醇氧化酶基因序列，獲得膽固醇氧化酶基因保守序列信息，設(shè)計并合成一對簡并引物，用來從不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組

7、中擴(kuò)增膽固醇氧化酶基因片段，簡并引物序列如下。上游引物：下游引物：加入了、兩個酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件：，；個循環(huán)，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。年第期吳紅艷等：一種高效可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組的提取方法，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品：（）模板為凍融法（二）提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）、（）、（）模板為溶菌酶破壁法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）模板為微波法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）為標(biāo)準(zhǔn)（）為陰性對照（）為模板；瓊脂糖凝膠濃度：電壓：電泳時間：；觀察：紫外燈觀察照相。結(jié)果與討論結(jié)果凍融法提?。ǘ?、微波法快速提取放線菌基因不吸水鏈霉菌基因組提取凍融法提?。ㄒ唬?、組、溶菌酶破壁法提取基因組均得到白色沉淀。

8、基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖）。以提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖）。圖基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果凍融法（一）提取的基因組、凍融法（二）提取、的基因組、微波破壁法提取的基因組、溶菌酶破壁法提取的基因組、標(biāo)準(zhǔn)樣品以提取的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果模板為凍融法（二）提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物、模板為溶菌酶破壁法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物、模板為微波法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)為陰性對照為模板圖討論不吸水鏈霉菌基因組提取經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果看到。凍融法提?。ㄒ唬┲械玫降牟晃溍咕蚪M看不到帶，說明已經(jīng)降解或者所提取的濃度很低，無法由電泳檢測。凍融法提?。ǘ┲械玫降?/p>

9、可以看到清晰的帶，但是還可以看到和基因組帶濃度相近的幾條帶，這說明所提取的樣品純度較低，有很多雜質(zhì)存在，這將很大程度的影響擴(kuò)增結(jié)果。分析原因可能因?yàn)榘褍鋈诜ㄌ崛。ㄒ唬┲泻竺娴膩喚返募兓^程去掉以后，純化過程減少，因而純度降低，而且經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)表明使用此方法提取不吸水鏈霉菌基因組時結(jié)果不穩(wěn)定，每次提取的樣品純度各不相同，并存在降解的現(xiàn)象。微波法提取的基因組同樣可以看到一條清晰的帶，雖然純度較好，但是濃度較低。另外，在提取基因組進(jìn)行微波破壁的時候，所用的功率，時間等都有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。溶菌酶破壁法提取的基因組可以看到一條很明亮的帶，濃度很高，無其它的雜帶顯示，利用這種方法提取不吸水鏈霉菌基因組

10、，穩(wěn)定，濃度高，純度好。以不同方法提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，由結(jié)果可以看出，以凍融法（二）提取的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增后無帶顯示，可能由于模板中雜質(zhì)太多，影響反應(yīng)，未能擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)失敗。以微波法提取的基因組為模板擴(kuò)增后有特異性帶出現(xiàn)，但是濃度很低，影響回收、純化，以至于酶切等實(shí)驗(yàn)研究。而以溶菌酶破壁法提取的基因組為模板擴(kuò)增后顯現(xiàn)明亮的帶，特異性強(qiáng)，且濃度較高，可以用于回收、純化、酶切等等實(shí)驗(yàn)，所以此種方法是一種高效的可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組提取方法。（下轉(zhuǎn)第頁）生物技術(shù)通報年第期的幼胚，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對所得潮霉素抗性水稻植株的和析表明：基因已經(jīng)整合

11、到受體基因組中。代轉(zhuǎn)基因植株根的生長被葡萄糖所抑制，表現(xiàn)出對葡萄糖的敏感性，這一研究表明了基因可能與糖信號的傳導(dǎo)有關(guān)。即可能說明在葡萄糖作用下，其信號傳導(dǎo)起到正調(diào)控作用。其中葉綠素降低，葉綠素的值比野生型低，說明超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株葉片葉綠素降低主要是由于葉綠素減少所引起的作用。秦春圃! （上接第頁）參考文獻(xiàn)徐平，等微生物學(xué)通報，（）：徐平，等中國抗生素雜志，（）：鄭景生，等分子植物育種，（）：銀國利，等西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，（）：! 中國科技核心期刊、全國優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊植物遺傳資源學(xué)報征訂啟事植物遺傳資源學(xué)報是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和中國農(nóng)學(xué)會主辦的學(xué)術(shù)期刊，為中國科技核心期刊、全國優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊。該刊為中國科技論文統(tǒng)計源期刊、中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫來源期刊（核心期刊）、中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫收錄期刊、中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計源期刊，又被中國生物學(xué)文摘和中國生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫收錄。據(jù)中國期刊引證研究報告統(tǒng)計，年度植物遺傳資源學(xué)報影響因子達(dá)。報道內(nèi)容為大田、園藝作物，觀賞、藥用植物，林用植物、草類植物及其一切經(jīng)濟(jì)植物的有關(guān)植物遺傳資源基礎(chǔ)理論研究、應(yīng)用研究方面的研究成果、創(chuàng)新性學(xué)術(shù)論文和高水平綜述或評