臨床微生物學檢驗之藥敏

1、臨床微生物學檢驗一、 紙片擴散法又稱Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌藥物的選擇上具有靈活性，且花費低廉，被WHO推薦為定性藥敏試驗的基本方法，已在臨床廣泛使用。（一） 實驗原理 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關。（二） 培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片1、 抗菌藥物紙片 選擇直徑為6.35mm，吸水量為20µl的專用藥敏紙片，用逐

2、片加樣或侵泡方法使每片含藥量達規(guī)定所示。含藥紙片密封貯存28或-20無霜冷凍箱內保存，-內酰胺類藥敏紙片應冷凍貯存，且不超過一周。使用前將貯存容器移至室溫平衡12小時，避免開啟貯存容器時產生冷凝水。2、 培養(yǎng)基 水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培養(yǎng)基是CLSI采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，pH為7.27.4，對那些營養(yǎng)要求高的細菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需加入補充物質。瓊脂厚度為4mm。配置瓊脂平板當天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前應將平板置35溫箱孵育15分鐘，使其表面干燥。（三） 實驗方法 實驗菌株和標準菌株接種采用直接菌落法或細菌液體生長法

3、、用0.5麥氏比濁管標準的菌液濃度，校正濃度后的菌液應在15分鐘內接種完畢。操作步驟如下：1、 接種 用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內壁將多余菌液旋轉擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉平板60度，最后沿平板內緣涂抹一周。2、 貼抗菌藥物紙片 平板置室溫下干燥35分鐘，用紙片分配器或無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距24mm，紙片距平板內緣15mm，紙片貼上后不可再移動，因為抗菌藥物會自動擴散到培養(yǎng)基內。3、 孵育 置35孵育箱1618小時后閱讀結果，對苯唑西林和萬古霉素敏感等應孵育24小時。（四） 結果判斷和報告 用游標卡尺或直尺量取抑菌圈直徑（抑菌圈的邊緣應是無明顯細菌生

4、長的區(qū)域），先量取質控菌株的抑菌環(huán)直徑，以判斷質控是否合格；然后量取試驗菌株的抑菌環(huán)直徑。根據(jù)CLSI標準，對量取的抑菌圈直徑作出“敏感”、“耐藥”、“中介”的判斷。（五） 質量控制 對于腸桿菌科細菌，M-H瓊脂，生長法或直接菌落懸液法，相當于0.5麥氏標準的細菌濃度，35+-2，空氣，1618小時觀察結果，質控菌株推薦為大腸埃希菌ATCC25922，大腸埃希菌ATCC35218（為監(jiān)控-內酰胺酶/-內酰胺抑制劑紙片用）；對于銅綠假單胞菌ATCC35218；對于葡萄球菌屬細菌，1618小時觀察結果，測苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和萬古霉素需24小時，試驗溫度超過35不能檢測甲氧西林耐藥葡萄球菌

5、，推薦質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，大腸埃希菌ATCC35218，紙片擴散法檢測葡萄球菌對萬古霉素的敏感性不可靠；對于腸球菌屬細菌，1618小時觀察結果，測萬古霉素需24小時，推薦質控菌株為糞腸球菌ATCC29212;對于流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌，推薦質控菌株為流感嗜血桿菌ATCC49247，流感嗜血桿菌ATCC49766，大腸埃希菌ATCC35218（測試阿莫西林/克拉維酸時）；對于肺炎鏈球菌和肺炎鏈球菌之外其他鏈球菌，培養(yǎng)基為M-H瓊脂+5%羊血，35+-2，5%CO2,2024小時觀察結果，推薦質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619.二、 稀釋法（一） 肉湯稀釋法1、

6、培養(yǎng)基 使用M-H肉湯，需氧菌、兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長良好。在該培養(yǎng)液中加入補充成分可支持流感嗜血桿菌、鏈球菌生長。培養(yǎng)基制備完畢后應校正pH為7.27.4（25）。離子校正的M-H肉湯（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB）為目前推薦的藥敏試驗培養(yǎng)基。2、 藥物稀釋 藥物原液的制備和稀釋遵照CLSI的指南進行。3、 菌種接種 配制0.5麥氏濃度菌液，用肉湯（宏量稀釋法）、蒸餾水或生理鹽水（微量稀釋法）稀釋菌液，使最終菌液濃度（每管或每孔）為5x105CFU/ml，稀釋菌液于15分鐘內接種完畢，35孵育1620小時，當試驗菌為嗜血桿菌屬、鏈球

7、菌屬孵育時間為2024小時，葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古霉素的藥敏試驗應孵育時間為24小時。4、 結果判斷 以在試管內或小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）(µg/ml)。微量稀釋法時，常借助于比濁計判別是否細菌生長。有時根據(jù)需要測定最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration,MBC）;把無菌生長的試管（微孔）吸取0.1ml加到冷卻至50M-H瓊脂混合傾注平板，同時以前述的稀釋1:1000（或1:200）的原接種液作傾注平板，培養(yǎng)4872小時后計數(shù)菌落

8、數(shù)，即可得到抗菌藥物的最小殺菌濃度。5、 質量控制 對于常見需氧菌和兼性厭氧菌，M-H瓊脂，孵育時間、環(huán)境、質控菌株同紙片擴散法。（二） 瓊脂稀釋法 瓊脂選擇法是將藥物混勻于瓊脂培養(yǎng)基中，配制含不同濃度藥物平板，使用多點接種器接種細菌，經孵育后觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含藥物濃度測得MIC。1、 培養(yǎng)基 M-H瓊脂為一般細菌藥敏試驗的最佳培養(yǎng)基，調整pH在7.27.4，pH的過高或過低會影響藥物效能。2、 含藥瓊脂制備 將已稀釋的抗菌藥物按1:9加入在4550水浴中平衡融化M-H瓊脂中，充分混合傾入平皿，瓊脂厚度為34mm。室溫凝固后的平皿裝入密封塑料袋中，置28，貯存日期為

9、5天，對易降解藥物如頭孢克洛，在使用48小時之內制備平板，使用前在室溫中平衡，放于溫箱中30分鐘使瓊脂表面干燥。3、 細菌接種 將0.5麥氏比濁度菌液稀釋10倍，以多點接種器吸?。s為12µl）接種于瓊脂表面，稀釋的菌液于15分鐘內接種完畢，使平皿接種菌量為1 x104CFU/點。接種后置35 孵育1620小時，特殊藥需要24小時。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置于5%CO2，幽門螺桿菌置微需氧環(huán)境中孵育。4、 結果判斷 將平板置于暗色、無反光表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的藥物稀釋度為終點濃度。藥敏試驗的結果報告可用MIC（µg/ml）或對照CLSI標準用敏感（S）、中介（I

10、）和耐藥（R）報告。有時對于稀釋法的批量試驗，需要報告MIC50、MIC90.MIC50是指抑制50%試驗菌的最低藥物濃度，MIC90是指抑制90%試驗菌株的最低藥物濃度，例如被測大腸埃希菌100株，抗菌藥物為頭孢哌酮，在8µg/ml時可抑制90株大腸埃希菌生長，此時頭孢哌酮對大腸埃希菌的MIC90是8µg/ml。三、E-testE-test法（epsilometer test）是一種結合稀釋法和擴散法原理對抗菌藥物藥敏試驗直接定量的藥敏試驗技術。1.原理 E試條是一種5mmx50mm的無孔試劑載體，一面固定有一系列預先制備的，濃度呈連續(xù)指數(shù)增長稀釋抗菌藥物，另一面有讀數(shù)和

11、判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有20個MIC對倍稀釋濃度的寬度范圍，其斜率和濃度范圍對判別有臨床意義的MIC范圍和折點具有較好的關聯(lián)。 將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經孵育過夜，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，其邊緣與試條交點的刻度即為抗菌藥物抑制細菌的最小抑菌濃度。2、 培養(yǎng)基 需氧菌和兼性厭氧菌：M-H瓊脂；MRSA/MRSE：M-H瓊脂+2%NaCl;肺炎鏈球菌：M-H瓊脂+5%脫纖維羊血；厭氧菌：布氏桿菌血瓊脂；嗜血桿菌：HTM；淋病奈瑟菌：GC+1%添加劑。3、 細菌接種 對于常見需氧菌和兼性厭氧菌，使用厚度為4mmM-H瓊脂平板，用0.5麥氏濃度的對數(shù)期菌液涂布，待瓊脂平板完

12、全干燥，用E試條加樣器或鑷子將試條放在已接種細菌的平板平面，試條全長應與瓊脂平板緊密接觸，試條MIC刻度面朝上，濃度最大處靠平板邊緣。4、 結果判斷和報告 讀取橢圓環(huán)與E試驗試條的交界點值，即為MIC。問與答：1. 何為藥物敏感性試驗？其目的是？測定抗感染藥物在體外對病原微生物有無抑菌或殺菌作用的方法稱為藥物敏感性試驗（antibiotic susceptibility test ），簡稱藥敏試驗（AST）。藥敏試驗的目的是檢測可能引起感染的細菌對一種或多種抗菌藥的敏感性。事實上，體外藥敏試驗是對一種抗菌藥在體內治療有效性預測的先決條件，可供臨床醫(yī)生在治療患者時合理選擇用藥。此外，藥敏試驗還可

13、監(jiān)測細菌耐藥性變化。通過對某一病房、醫(yī)療機構、地區(qū)或國家的細菌耐藥性進行流行病學追蹤，調整他們的經驗用藥規(guī)程，定期修訂臨床抗菌譜內容，可為醫(yī)院制定預防措施提供依據(jù)。2. 何為CLSI?我國藥敏試驗結果判斷參照哪個標準？CLSI指的是臨床實驗室標準化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute）(以前稱NCCLS)，是一個國際性的、學科間的、非盈利性的、制定標準的教育機構，它促使人們對標準和指南達成共識并促進其在醫(yī)療保健系統(tǒng)內的應用。在為臨床試驗與相關的醫(yī)療問題制定標準和指南時，CLSI實施了它所特有的達成一致的過程，因而得到全世界的認可。若要經

14、濟而有效的提供臨床試驗和醫(yī)療保健水平，就應該具備一致的標準，這便是CLSI的原則基礎。目前，我國藥敏試驗結果判斷標準參照CLSI標準文件，CLSI文件是我國的衛(wèi)生部部頒文件。3. 藥敏試驗報告中的S、I、R分別表示什么意思？S:敏感（susceptible，S），當一種細菌引起的感染，用某種藥物的常規(guī)量時治療有效，這種細菌即對該藥高度敏感。即常規(guī)用藥時達到的平均血藥濃度為對細菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）的5倍或以上。I:中度敏感（intermediate，I），當細菌引起的感染僅在應用高劑量抗菌藥時有效，或者細菌處于體內抗菌藥濃縮

15、的部位或體液（如尿、膽汁、腸腔等）中時才被抑制，這種細菌對該藥僅呈中度敏感。通常用藥時達到的平均血藥濃度一般相當于或略高于對細菌的MIC。對于毒性較小的藥物，可適當加大劑量仍可望獲得臨床療效。R:耐藥（resistant，R），藥物對某一細菌的MIC高于藥物在血或體液內可能達到的濃度時，或有時細菌能產生滅活抗菌藥的酶，則無論其MIC值大小如何，仍應判定該菌為耐藥。例如產青霉素酶的金黃色葡萄球菌即應認為該菌對青霉素耐藥。12.什么情況下需要做藥敏試驗？已查明病原菌，需要幫助醫(yī)師選擇最合適的抗菌藥物者為進行細菌耐藥性監(jiān)測和了解本地區(qū)的耐藥性變遷，必須有細菌藥敏測定結果以建立細菌耐藥性數(shù)據(jù)庫新抗菌藥

16、物的藥效學評價，必須進行藥敏測定以獲得該藥的MIC50和MIC90，MIC50和MIC90以及抑菌率等評價指標。以下情況不需要做藥敏測定：已知某些抗菌藥物對某種細菌有良好的抗菌作用，而且很少有耐藥株存在，例如溶血性鏈球菌和腦膜炎奈瑟球菌等可能是污染菌而不是引起發(fā)病的真正病原菌對一些營養(yǎng)要求較高，不易生長的細菌，一般也可不做常規(guī)藥敏測定，例如淋病奈瑟球菌和流感嗜血桿菌。必要時可進行有計劃的調查研究。1. 什么是紙片擴散法？其原理是？紙片擴散法試驗就是Kirby-Bauer(K-B)試驗，是臨床微生物實驗室最常規(guī)的藥物敏感試驗的方法。其原理是：將浸有抗菌藥的紙片貼在涂有細菌的瓊脂平皿上，抗菌藥在瓊

17、脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制，過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，其直徑大小與藥物濃度的對數(shù)呈線性關系。通過游標卡尺或直尺對這些抑菌 圈直徑大小進行測量，然后將測量結果與CLSI文件上所列的判斷標準進行比較，從而判斷測試菌株對各種抗菌藥的敏感性。2、步驟？1）藥敏平皿的制備2）待測菌的菌液制備3）菌液接種4）含抗菌藥紙片的放置。完成上述3個步驟后，放入35溫室或溫箱培養(yǎng)1618小時后閱讀結果。由于其在抗菌藥物的選擇上具有靈活性，且花費低廉，被WHO推薦為定性藥敏試驗的基本方法，已在臨床廣泛使用。（六） 實驗 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂平

18、板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中的水分溶解后不斷向紙片周圍擴散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內測試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測試菌對測定藥物的敏感程度，并與該藥對測試菌的MIC呈負相關。（七） 培養(yǎng)基和抗菌藥物紙片5、 抗菌藥物紙片 選擇直徑為6.35mm，吸水量為20µl的專用藥敏紙片，用逐片加樣或侵泡方法使每片含藥量達規(guī)定所示。含藥紙片密封貯存28或-20無霜冷凍箱內保存，-內酰胺類藥敏紙片應冷凍貯存，且不超過一周。使用前將貯存容器移至室溫平衡12小時，避免開啟貯存容器時產生冷凝水。6、 培養(yǎng)基 水解酪蛋白（Mueller-H

19、inton,M-H）培養(yǎng)基是CLSI采用的兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗標準培養(yǎng)基，pH為7.27.4，對那些營養(yǎng)要求高的細菌如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、鏈球菌等需加入補充物質。瓊脂厚度為4mm。配置瓊脂平板當天使用或置塑料密封袋中4保存，使用前應將平板置35溫箱孵育15分鐘，使其表面干燥。（八） 實驗方法 實驗菌株和標準菌株接種采用直接菌落法或細菌液體生長法、用0.5麥氏比濁管標準的菌液濃度，校正濃度后的菌液應在15分鐘內接種完畢。操作步驟如下：4、 接種 用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內壁將多余菌液旋轉擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3次，每次旋轉平板60度，最后沿平板內緣涂抹一周。5、 貼抗菌藥物紙片 平板置室溫下干燥35分鐘，用紙片分配器或無菌鑷子將含藥紙片緊貼于瓊脂表面，各紙片中心相距24mm，紙片距平板內緣15mm，紙片貼上后不可再移動，因為抗菌藥物會自動擴散到培養(yǎng)基內。6、 孵育 置35孵育箱1618小時后閱讀結果，對苯唑西林和萬古霉素敏感