農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)綜述

1、農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展鄧敏姬 鄧敏航 鄭琪 黃卿儀 易蜀婷 摘要：主要綜述了農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)中目前廣泛應(yīng)用的酶抑制檢測法、酶聯(lián)免疫檢測法、活體生物測定法、生物傳感器法和儀器分析法等快速測定方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其進(jìn)展，指出了農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)中存在的問題和發(fā)展方向。關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留；酶抑制；酶聯(lián)免疫；活體生物測定；生物傳感器；速測Abstract：Summary of the pesticide residues in the main detection technique is currently widely used in the enzyme inhibition assay,

2、 enzyme-linked immunosorbent assay, in vivo bioassay, biological sensors and analysis equipment, such as the rapid determination of the principles, strengths and weaknesses and progress. Pointed out the technology for rapid detection of pesticide residue problems and development direction.Keywords:

3、pesticide residues; enzyme inhibitor; enzyme-linked immunosorbent assay; vivo bioassay; biological sensors; speed test正文：長期以來，由于人們在防治農(nóng)作物病蟲害過程中不合理和超劑量使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量越來越高，影響了農(nóng)產(chǎn)品的出口和人民的健康，也破壞了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。當(dāng)前世界各國政府正在不斷加強(qiáng)農(nóng)藥殘留的監(jiān)測工作，對農(nóng)藥殘留檢測靈敏度和效率的要求逐步提高，對快速檢測分析新技術(shù)的開發(fā)也日益重視。常規(guī)的農(nóng)藥殘留分析方法如液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質(zhì)譜

4、(MS)法等，均存在著樣品前處理復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴、分析費(fèi)時(shí)長、要求熟練的技術(shù)人員才能完成等問題。由于這些方法不能滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求，迫使人們運(yùn)用新的原理和方法去開發(fā)特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、準(zhǔn)確安全的快速檢測新技術(shù)。本文主要綜述了目前廣泛應(yīng)用的酶抑制法、酶聯(lián)免疫分析方法、活體生物測定方法和生物傳感器法等快速測定方法的研究進(jìn)展。1酶抑制法1.1酶抑制法是一種簡便、靈敏、經(jīng)濟(jì)的快速檢測方法，是相對成熟的一種對部分農(nóng)藥進(jìn)行殘留速測技術(shù)。它基于有機(jī)磷農(nóng)藥對酶活性的抑制作用，適用于有機(jī)磷和氨基甲酸酪類農(nóng)藥。1,2在目前條件下，酶抑制法是凈化蔬菜市場的一種有效可行的方法，其優(yōu)點(diǎn)是能對抑制膽堿

5、酯酶的農(nóng)藥品種進(jìn)行快速靈敏的檢測、樣品前處理簡單、檢測時(shí)間短、所需儀器設(shè)備簡單、適用于現(xiàn)場測定。缺點(diǎn)是使用的酶基質(zhì)和顯色劑有一定的特異性，需控制的條件比較多。31.2影響因素1：1)溫度和PH對酶促反應(yīng)的影響: 酶的活性都隨著溫度的升高先升高后降低;2)時(shí)間對酶促反應(yīng)的影響；3）溫度和農(nóng)藥品種對農(nóng)藥抑制作用的影響:在一定的溫度范圍內(nèi)(25-45 )植物酯酶和乙酰膽堿酯酶受到農(nóng)藥的抑制作用都是隨著溫度的升高而增強(qiáng)；4）時(shí)間對農(nóng)藥抑制作用的影響:抑制時(shí)間越長，農(nóng)藥的抑制作用越強(qiáng)。1.3酶抑制法根據(jù)所使用的酶的種類不同可大致分為兩類:膽堿酯酶法和植物酯酶法。11.3.1膽堿酯酶法原理：乙酰膽堿酯酶(

6、AChE)抑制法的檢測原理以乙酰膽堿為底物，在AChE的作用下，乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿和二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)產(chǎn)生顯色反應(yīng)，使反應(yīng)液呈黃色。1特點(diǎn)：操作簡單測定所需的時(shí)間短不需要貴重的儀器費(fèi)用較低適合于現(xiàn)場的快速檢測，AChE抑制法雖然在回收率和精密度上較經(jīng)典方法差一些，但可以滿足半定量的要求適合于我國的小規(guī)模分散式的農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)與經(jīng)銷體系。另外，各種農(nóng)藥因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理不同對AChE的抑制能力也不相同，氧化型有機(jī)磷的抑制能力較強(qiáng)，AChE抑制法對其的靈敏度較高最小檢出濃度較低；而硫代型有機(jī)磷的抑制能力較差，最小檢出濃度較高；但辛硫磷因?yàn)楹须炕x擇毒力大大增強(qiáng)最小，檢出濃度

7、較低；對氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測靈敏度相對都比較高。1.3.1.1比色法4比色法是酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測測定技術(shù)中最常采用的一種方法，也是最簡單的一種測定技術(shù)。原理：它通過酶水解底物碘化硫代乙酰膽堿，生成的碘化硫代膽堿，能與5，5一二硫代一2，2二硝基苯甲酸(DTNB)作用，生成5一琉基一2一硝基苯甲酸(黃色)。于特征波長(410.nom)下進(jìn)行比色，測定吸光值，根據(jù)吸光值的大小，計(jì)算乙酰膽堿酯酶被抑制的程度，并通過與農(nóng)藥濃度進(jìn)行回歸分析，建立回歸方程，從而通過測定未知樣品對酶活性的抑制率求出樣品中殘留農(nóng)藥的量的一種方法。特點(diǎn)：利用此方法對蔬菜、果品及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量進(jìn)行測定，靈敏度高、操作

8、簡便、檢驗(yàn)速度快，可檢測多種農(nóng)藥的綜合殘留量。但由于酶易失活，不易保存，檢測時(shí)受溫度影響，需要控制的條件較多。1.3.1.3速測卡法4原理：速測是根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥能夠強(qiáng)烈抑制小麥酯酶的活性這一特性研制而成,農(nóng)藥殘留速測卡法是應(yīng)用農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶抑制原理設(shè)計(jì)的一種根據(jù)顏色變化的直觀檢測方法5。其中紅色藥片為有2，6一二氯靛酚乙酸酯的經(jīng)真空干燥后的濾紙片，白色藥片含有小麥酯酶。方法：在使用時(shí)將1一2滴樣品液滴到白色藥片上，對折速測卡使兩藥片重疊。如果樣品中不含有機(jī)農(nóng)藥，那么2，6一二氯靛酚乙酸酯在小麥酯酶的作用下迅速發(fā)生水解反應(yīng)，生成藍(lán)色靛酚和乙酸，因而白色藥片會(huì)顯藍(lán)色;如果樣品中含有少量有機(jī)磷農(nóng)

9、藥，則有機(jī)磷農(nóng)強(qiáng)烈抑制小麥酯酶的活性，使得2，6一二氯靛酚乙酸酯的水解反應(yīng)不能進(jìn)行，白色藥仍然保持白色或呈淺藍(lán)色。1.3.2植物酶抑制法原理5：利用植物酯酶水解2,6-二氯乙酰靛酚，水解產(chǎn)物靛酚為藍(lán)色，最大吸收波長為605 nm，根據(jù)反應(yīng)溶液在水解前后顏色的變化，用目測或儀器來判定農(nóng)藥對酶的抑制程度，從而判斷有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留量。特點(diǎn)：在利用酶抑制原理測定農(nóng)藥殘留的方法中，植物酯酶與動(dòng)物酯酶相比，抑制程度的各項(xiàng)指標(biāo)均不遜色很多，同時(shí)又具有酶源方便易得，提取、保存方便，成本低等優(yōu)勢。但是目前的研究表明植物酷酶方法的精確度和靈敏度不及乙酰膽堿酯酶法，乙酰膽堿酯酶法的檢出限數(shù)量級在0.0

10、01 mg/kg附近，而植物酯酶法只能在0. l mg/kg附近，靈敏度較低。2.酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）2.1原理：EllSA的核心技術(shù)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。ELISA的基本原理是將抗原抗體之間的特異性免疫反應(yīng)和酶對底物的高度催化效應(yīng)結(jié)合起來，以酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級免疫反應(yīng)。它既可測抗原也可測抗體。62.2方法：EUSA需要固相載體作為吸附劑，用固相載體吸附抗體(抗原)，加待測抗原(抗體)，再與相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原)進(jìn)行抗原抗體特異免疫反應(yīng)，生成抗體(抗原)一待測抗原(抗體)一酶標(biāo)記抗體(抗原)復(fù)合物，最后再與該酶底物發(fā)生反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。待測抗原(抗體)定量與有色產(chǎn)物量成正比

11、，因此可借吸光度值計(jì)算抗原(抗體)量。ELISA法既可進(jìn)行定性測定，又可進(jìn)行定量測定。在上述反應(yīng)中，酶促反應(yīng)只進(jìn)行一次，而抗原一抗體免疫反應(yīng)可進(jìn)行一次或數(shù)次。72.3應(yīng)用：ELISA技術(shù)還可應(yīng)用于食品中其它成分的測定,抗?fàn)I養(yǎng)素因子如大豆及其制品中的胰蛋白酶抑制因子;食品營養(yǎng)成分如牛初乳中乳鐵蛋白含量等;食品加工過程中的酶的含量的變化;檢測某些特定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白,以分析食品是否來自轉(zhuǎn)基因生物或者含有轉(zhuǎn)基因成分8。2.4影響因素：影響因素一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報(bào)告及解釋等方面。92.5前景：免疫分析法以其固有的優(yōu)勢，在農(nóng)藥殘留分析中日益顯

12、示出強(qiáng)大的應(yīng)用前景。其中以EUSA技術(shù)最活躍，EHSA具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便、痕量檢測，以及可大批量樣本檢測的優(yōu)點(diǎn)，其檢測限可達(dá)到納克甚至更低濃度降24。到現(xiàn)在為止，國際上已有上百種農(nóng)藥可用免疫分析法檢測，且已制成商品化快速檢測試劑盒或試劑條。目前我國已研制出6種農(nóng)藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(甲霜靈、甲胺磷、毒死蟀、對硫磷、2，4一D、百菌清)，膠體金免疫快速檢測試紙16種(3，5，6一三氯二毗吮醇、苯菌靈、除草定、丁草胺、毒死蟀、禾草靈、甲草胺、甲蔡威、甲霜靈、霜霉威、西瑪津、嗅苯睛、乙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、芬去津);另外研制出高效快速地檢測生物毒素的免疫檢測試劑盒13種和免

13、疫膠體金紙條5種;研制出獸藥殘留酶聯(lián)免疫檢測試劑盒11種，其中有些試劑盒已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益固。與國外相比，國內(nèi)在這方面的研究相對較少，但正越來越受到研究檢測工作者的高度重視，目前研發(fā)各種農(nóng)藥殘留檢測試劑盒的步伐日益加快，所以EllSA法在農(nóng)藥殘留檢測中將有廣闊的應(yīng)用前景。6抗體特異性及靈敏性雖有較大程度提高;但仍不能同時(shí)檢測數(shù)十種甚至更多農(nóng)藥殘留。用于食品農(nóng)藥殘留檢測，在檢測單個(gè)農(nóng)藥時(shí)具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn);但由于農(nóng)藥品種繁多及混配使用等原因，在檢測大批樣品時(shí)，仍顯得無能為力。73.活體生物測定3.1原理：活體檢測法是使用活的生物體直接測定。如農(nóng)藥與細(xì)菌作用后可影響細(xì)菌

14、的發(fā)光強(qiáng)度，以檢測農(nóng)藥殘留量。3.2方法3.2.1用發(fā)光細(xì)菌檢測農(nóng)藥殘留發(fā)光細(xì)菌體內(nèi)的熒光素在有氧時(shí)經(jīng)熒光酶的作用會(huì)產(chǎn)生熒光，但當(dāng)受到某些有毒化合物的作用時(shí)發(fā)光會(huì)減弱，其減弱的程度與有毒物的濃度呈一定的線性關(guān)系，利用這一特點(diǎn)對農(nóng)藥殘留試樣進(jìn)行測定12。該方法的特點(diǎn)是快速、簡便、靈敏、價(jià)廉，適合于現(xiàn)場，缺點(diǎn)是農(nóng)藥濃度與發(fā)光強(qiáng)度的線性親系不夠準(zhǔn)確，只能用于半定量測定。3.2.2用家蠅檢測蔬菜中的殘留農(nóng)藥以采收前12天的蔬菜為檢測對象，隨機(jī)抽取檢測樣品，將飼料放于菜汁中，接觸后34h觀察死亡率，并且需要用無農(nóng)藥污染的蔬菜作為對照。死亡率在4%以下為安全或較安全;死亡率在5%10%蔬菜中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)

15、;死亡率大于11%表示污染嚴(yán)重或極嚴(yán)重12。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無需儀器，無需前處理，過程簡單。缺點(diǎn)是無法定量，檢測時(shí)間比較長，敏感性家蠅飼養(yǎng)比較困難。4生物傳感器法生物傳感器是將傳感技術(shù)與農(nóng)藥免疫技術(shù)相結(jié)合而建立起來的，可以說它是免疫分析技術(shù)的一種延伸或分支。根據(jù)生物功能不同主要分為不同類型傳感器，利用農(nóng)藥對靶酶活性的抑制作用研制傳感器時(shí)，應(yīng)選擇活性高而其活性對農(nóng)藥敏感的酶作為生物傳感器稱為酶傳感;利用農(nóng)藥與特異性抗體結(jié)合特性研制免疫傳感器;另外還微生物傳感器和組織傳感器等等11。4.1原理：生物敏感膜內(nèi)含有能與目標(biāo)物進(jìn)行選擇性作用的生物活性組分;換能器則能敏感捕捉生物活性組分與目標(biāo)物之間的作用過

16、程，并將其表達(dá)為可檢測的物理信號。當(dāng)待測物與具有分子識(shí)別作用的利用特殊技術(shù)固定在換能器內(nèi)(或表面)的生物活性因子作用時(shí)，產(chǎn)生光學(xué)、熱學(xué)、壓電學(xué)或電化學(xué)等響應(yīng)信號，最后把所得的電信號經(jīng)過電子技術(shù)的處理后，在儀器上顯示或記錄下來，其信號大小與分析物含量或濃度存在定量關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對待測物質(zhì)的定量檢測10。4.2應(yīng)用：Ngeh一Ngwainbi等最早研究成功了對硫磷的生物傳感器，以后又有人制成了光導(dǎo)纖維免疫傳感器，利用熒光標(biāo)記抗體產(chǎn)生的反應(yīng)，分析測定對硫磷在溶液中含量13。生物傳感器能廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物、臨床化學(xué)和診斷、農(nóng)業(yè)和畜牧獸醫(yī)、化學(xué)分析、軍事、過程控制與監(jiān)測、環(huán)境監(jiān)控與保護(hù)等領(lǐng)域。隨著

17、生物、化學(xué)、物理學(xué)、醫(yī)學(xué)、電子技術(shù)等相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展，生物傳感器的發(fā)展也被帶動(dòng)，各種類型的生物傳感器相繼出現(xiàn)。生物傳感器相對于酶免疫吸附測定法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速且減少了樣品的前處理。適于野外快速監(jiān)測，減少有機(jī)溶劑使用量。雖然生物傳感器在實(shí)驗(yàn)室條件下使用狀態(tài)良好，但在實(shí)際中還沒有廣泛應(yīng)用，其最大優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性、精確度和可信度。它的缺點(diǎn)是一種傳感器只能對應(yīng)一種或一類農(nóng)藥，應(yīng)用范圍窄，研究過程長，不易制備10。生物傳感器是一門跨學(xué)科的高新技術(shù)，起步較晚，研制過程有諸多難點(diǎn)，在實(shí)際推廣應(yīng)用前還有許多待探索和改進(jìn)的地方。(1)生物傳感器壽命、穩(wěn)定性及制備的復(fù)雜性制約著研究成果商品化與批量生產(chǎn)； (2)

18、穩(wěn)定性：由于生物單元的引入，生物結(jié)構(gòu)固有的不穩(wěn)定、易變性給生物傳感器的應(yīng)用帶來不少困難。5儀器分析法5.1原理儀器分析法是指利用氣相色譜儀、液相色譜儀、質(zhì)譜儀或各種光譜儀等大型精密儀器來進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析的方法?；谏V和質(zhì)譜的分析方法檢測精度高、重復(fù)性好，是農(nóng)藥殘留定量檢測分析的主要方式。但這些方法不僅需要大型的儀器設(shè)備，而且需要比較復(fù)雜的前處理過程，檢測時(shí)間較長，無法適應(yīng)大批量快速檢測的需要；而直接基于光譜分析的近紅外光譜分析法和激光誘導(dǎo)熒光光譜分析法無需復(fù)雜的前處理過程，可實(shí)現(xiàn)非破壞性的實(shí)時(shí)檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。5.2方法5.2.1近紅外光譜分析技術(shù)5.2.1.1原理：近紅外衰減全反射

19、光譜技術(shù)(NIR-ATR)是根據(jù)不同種類的農(nóng)藥對近紅外光具有不同吸收頻段的特性，通過近紅外衰減全反射光譜分析進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的檢測。在中紅外波段,蔬菜體內(nèi)的色素對農(nóng)藥的吸收基本沒有影響;農(nóng)藥在蔬菜汁中與在蒸餾水中的吸收基本相同。通過農(nóng)藥在水中的吸收建立模型來模擬其在蔬菜體內(nèi)的吸收。5.2.1.2研究進(jìn)展：近紅外光譜分析技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品外觀和內(nèi)部品質(zhì)檢測、食品生產(chǎn)過程控制等方面早已取得了成功應(yīng)用，其在農(nóng)藥殘留檢測方面的應(yīng)用雖然還未成熟，但已有很多學(xué)者進(jìn)行了大量的探索工作。應(yīng)用紅外光譜技術(shù)可以直接對蔬菜上的農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，而且該方法精確度高、實(shí)時(shí)性好，且只需極少量的樣品，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?45.2

20、.2激光誘導(dǎo)熒光光譜分析技術(shù)5.2.2.1原理：農(nóng)藥殘留物在激光照射下會(huì)產(chǎn)生熒光，由于不同農(nóng)藥熒光的頻譜分布、時(shí)間延遲及產(chǎn)生效率等特性往往具有明顯差異，因此通過對其激光誘導(dǎo)熒光特性的研究可以探測出農(nóng)藥殘留的種類及濃度。該法靈敏度較高，并可進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，而且熒光分析方法已被實(shí)踐證明具有靈敏度高（可達(dá)到10-9量級）、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，在對痕量物質(zhì)的檢測方面具有強(qiáng)大的生命力。5.2.2.2研究進(jìn)展：目前，國內(nèi)外基于激光誘導(dǎo)熒光光譜分析的農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)大都還處于原理和實(shí)驗(yàn)研究階段?？梢岳脽晒夤庾V的不同實(shí)時(shí)、實(shí)地和快速地識(shí)別糧食、蔬菜和水果表面上的農(nóng)藥殘留。156其他快速檢測法6.1“小分

21、子有害物質(zhì)的微流控芯片免疫傳感檢測技術(shù)根據(jù)表面等離子體諧振分析原理，在微流控芯片上成功實(shí)現(xiàn)了免疫傳感技術(shù)檢測。檢測方法不需標(biāo)記物，試劑消耗少，檢測周期短，具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。166.2實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人現(xiàn)已商品化，但在農(nóng)藥殘留量分析和環(huán)境監(jiān)測方面的應(yīng)用還處于起步階段，主要是因?yàn)闄C(jī)器人工作程序的變更缺乏靈活性和實(shí)驗(yàn)室檢測方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化所造成，另外機(jī)器人系統(tǒng)動(dòng)作緩慢，一般要求寬闊的空間。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人變得更方便、靈活，實(shí)驗(yàn)方法也更加標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，它的使用將會(huì)增加。17參考文獻(xiàn)：1王小紅。酶抑制法檢測蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的方法研究D。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)。2006.6.12錢立立。農(nóng)藥殘留的快