結(jié)核桿菌研究進(jìn)展(綜述)

1、結(jié)核桿菌DNA疫苗研究進(jìn)展結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO統(tǒng)計(jì),全世界約有20 億人感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌,每年約有200 300 萬(wàn)人死于結(jié)核病,其人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)的總和。20世紀(jì)末,結(jié)核病仍然是全球感染和傳染病的第一“殺手”。當(dāng)前唯一可用的疫苗-卡介苗(BacilleCalmette Guerin, BCG的免疫效果下降,對(duì)其保護(hù)效果也存在爭(zhēng)議,經(jīng)試驗(yàn)證明其總有效率僅為50 %。而且對(duì)成年人的免疫效果也不明確,因此現(xiàn)在急需研制出新型疫苗。目前新型結(jié)核疫苗研制方向主要有:減毒結(jié)核疫苗,高表達(dá)重組疫苗,蛋

2、白質(zhì)亞單位疫苗和DNA 疫苗(又稱核酸疫苗或基因疫苗等四種。本文就結(jié)核DNA 疫苗的新進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。1 DNA 疫苗的作用機(jī)理DNA疫苗的作用機(jī)理是能讓外源基因在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá),表達(dá)出來(lái)的蛋白質(zhì)和MHC-類分子結(jié)合后被呈遞到細(xì)胞的表面,再被CD8+T淋巴細(xì)胞的受體識(shí)別而誘發(fā)CTL的細(xì)胞毒反應(yīng),這對(duì)細(xì)胞內(nèi)寄生的結(jié)核桿菌有很強(qiáng)的殺傷作用。但目前對(duì)DNA 疫苗激活免疫系統(tǒng)的詳細(xì)機(jī)理還不是很清楚,不過(guò)有以下幾種機(jī)制可對(duì)此進(jìn)行解釋:DNA 疫苗直接致敏體細(xì)胞;基因疫苗轉(zhuǎn)染APC(抗原遞呈細(xì)胞-巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞;核酸疫苗在APC 內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原作為“內(nèi)源性抗原”,結(jié)合MHC-類分子后被T 細(xì)胞

3、受體識(shí)別,這是誘導(dǎo)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的最有效的途徑;交叉致敏;細(xì)菌質(zhì)粒具有免疫佐劑功能1。當(dāng)人或小鼠感染結(jié)核菌后,巨噬細(xì)胞(M吞噬結(jié)核菌但卻不能將其殺滅。因此結(jié)核菌在M中生存繁殖,外來(lái)藥物與抗體也無(wú)法直接消除結(jié)核菌。只有人M被抗原特異的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞溶解后,其中寄生的毒性結(jié)核菌才能被殺死。因此可以設(shè)想,殺菌性T 細(xì)胞的功能低下導(dǎo)致了小鼠感染結(jié)核菌后免疫抵抗力的下降,造成慢性感染,在人體也可發(fā)生類似情況。在主動(dòng)免疫的機(jī)制中,可溶性蛋白抗原主要刺激CD4+T 細(xì)胞反應(yīng),而DNA 疫苗則可引起強(qiáng)烈的CD8+T 細(xì)胞反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的抗原特異性CD8+/ CD4- / CD44 high T 細(xì)胞,分

4、泌IFN-2,引起有效的細(xì)胞免疫。2 編碼抗原基因重組的DNA 疫苗1996年8月出版的自然醫(yī)學(xué)雜志同時(shí)刊登了Huygen和T ascon兩位博士各自分別完成的結(jié)核病DNA疫苗的論文,1998 年英國(guó)劍橋Sanger 中心完成結(jié)核桿菌基因組序列的測(cè)定,為結(jié)核DNA 疫苗的研制提供了保證,使其研制進(jìn)入飛躍發(fā)展階段。實(shí)驗(yàn)證明結(jié)核桿菌在體外培養(yǎng)早期分泌的蛋白質(zhì)是主要的抗結(jié)核保護(hù)性抗原,因此主要的結(jié)核DNA疫苗都是將編碼這些抗原的基因克隆到載體中構(gòu)建而成的。目前結(jié)核DNA 疫苗的研制主要有:以Antigen85 和hsp65,以及結(jié)核桿菌培養(yǎng)過(guò)濾液中的分泌蛋白ESAT-6 和MPT-64 編碼基因重組

5、的DNA 疫苗3。2. 1 以Antigen85 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗在結(jié)核菌和BCG 的培養(yǎng)濾液中分泌蛋白的一個(gè)主要成分是Ag85復(fù)合體(Antigen85 complex,由Ag85A,Ag85B,Ag85C組成的3032kD 蛋白家族,分別由三種不同但高度同源的基因編碼。在感染結(jié)核或麻風(fēng)菌與卡介苗免疫的小鼠及人體上,Ag85 復(fù)合體不僅可以刺激產(chǎn)生體液免疫,尚可激發(fā)較強(qiáng)Th1 型細(xì)胞免疫,引起CD8+ T 細(xì)胞增殖和IL-2及IFN-等細(xì)胞因子水平的上升。結(jié)核病的免疫學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞免疫功能低下,研究結(jié)果顯示CD8+T細(xì)胞的保護(hù)功能可能與IFN-誘導(dǎo)有關(guān),這些實(shí)驗(yàn)揭示可利用Ag85

6、 復(fù)合體基因構(gòu)建DNA 疫苗。其中Ag85A 和Ag85B 被認(rèn)為更有效,一些實(shí)驗(yàn)已證實(shí),由Ag85A 和Ag85B 編碼的DNA 疫苗對(duì)小鼠抵抗由呼吸道或靜脈感染的結(jié)核菌有保護(hù)作用4,目前一些研究小組正在致力于此方面的研究。2. 1. 1 Ag85A用含結(jié)核菌38kD 蛋白基因與Ag85A 及HSP65 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗免疫的動(dòng)物模型中,可產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)作用。以人工合成的包括Ag85A 全部20 肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IL-2,IFN-為指標(biāo),發(fā)現(xiàn)DNA 免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的T細(xì)胞反應(yīng)在強(qiáng)度和廣度上均比皮下注射結(jié)核菌感染的效果好,CTL 活性也上升。編碼Ag85A 的DNA 疫苗與BC

7、G 有同樣的誘導(dǎo)保護(hù)作用。Huygen把結(jié)核桿菌的抗原85A基因克隆到美國(guó)Merk公司的VIJ載體中構(gòu)建了DNA疫苗,然后將DNA在體外轉(zhuǎn)染肌肉瘤細(xì)胞,證明了DNA疫苗能夠在真核細(xì)胞中表達(dá)結(jié)核桿菌的抗原85A蛋白質(zhì)。給Balb/c和C57BL/6小鼠肌肉注射Ag85A疫苗,能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)很強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。2. 1. 2 Ag85B由MTB (Mycobacterium tuberculosisH37Rv 基因組編碼,用其作為亞單位疫苗與多個(gè)蛋白疫苗比較或與其他基因疫苗比較4,均表明Ag85B 是MTB 較好的保護(hù)性靶抗原之一。研究表明Ag85B 基因免疫小鼠可以產(chǎn)生較高水平的IFN-

8、和脾淋巴細(xì)胞顯著增殖為特征的細(xì)胞免疫反應(yīng)。將此小鼠的T 細(xì)胞過(guò)繼免疫給正常小鼠后,對(duì)MTB 毒株的感染有一定的保護(hù)性5。相繼用編碼Ag85B的DNA 疫苗和卡介苗免疫,其對(duì)抵抗結(jié)核桿菌的感染比單獨(dú)用卡介苗更為有效6。Li和Kamath各自分別將Ag85B基因克隆到pJM4303載體中,用于免疫C57BL/6小鼠,都獲得了明顯的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。在用氣霧攻擊結(jié)核桿菌H37Rv毒菌后,均獲得了接近BCG的免疫保護(hù)力。2. 1. 3 Ag85C對(duì)于Ag85C 基因重組的DNA 疫苗,目前發(fā)現(xiàn)其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及85A 和85B 。也有研究人員對(duì)此進(jìn)行對(duì)比研究7。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)7利用tPA(Tissue

9、 plasminogen acti 2vator 組織纖維蛋白溶酶原激活因子信號(hào)序列為增強(qiáng)子可使編碼85A,85B 和ESAT-6 的重組疫苗高水平表達(dá),而Ag85C 編碼基因重組的DNA 疫苗卻沒(méi)有明顯效果。Ag85 基因重組疫苗免疫過(guò)的小鼠中,受tPA 免疫的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2,IFN-大大增加,利用tPA 信號(hào)序列可增強(qiáng)Ag85 基因重組疫苗的免疫原性,這為將來(lái)的疫苗設(shè)計(jì)起到重要啟示。2. 2 以hsp65編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗hsp65(Heat shock protein65是由HLA 2 DR 和2 DQ 復(fù)合基因編碼的65kD 蛋白。據(jù)Tascon 等人報(bào)道,表達(dá)麻風(fēng)分

10、枝桿菌hsp65 的重組質(zhì)粒有與BCG 相似的抗結(jié)核作用。以hsp 2 65 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-,使T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD8+ / CD44 hi T 細(xì)胞。將其接種后至8 個(gè)月保護(hù)性T細(xì)胞數(shù)量和免疫水平持續(xù)上升,15 月后逐漸下降8。在免疫后8 15 月,CTL 仍有作用。而與此對(duì)照,接種卡介苗,產(chǎn)生IFN-誘導(dǎo)T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+ /CD44 lo T 細(xì)胞,在過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中CD4+ /CD44 lo T 細(xì)胞被證實(shí)沒(méi)有免疫保護(hù)作用,而CD8+ /CD44 hi T 細(xì)胞才具有保護(hù)作用,因此接種DNA 疫苗的小鼠比接種卡介苗的小鼠更易受到保護(hù)。用全長(zhǎng)的Mhsp

11、65 編碼的DNA 疫苗可以誘導(dǎo)特異性MHC-和型T 細(xì)胞反應(yīng)9。因此在MHC -CTL 細(xì)胞介導(dǎo)的抗結(jié)核免疫反應(yīng)中Mhsp65(9369 有著廣闊研究前景,甚至可考慮用其來(lái)誘導(dǎo)免疫保護(hù)以抵抗更為廣泛的各種病原體。2. 3 以ESAT-6 編碼基因構(gòu)建的DNA 疫苗ESAT-6 是由結(jié)核分枝桿菌(M. t uberculosis毒株和牛型分枝桿菌(M. bovis毒株分泌的低分子量T 細(xì)胞抗原。它是結(jié)核桿菌早期分泌性蛋白質(zhì)中誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)能力最強(qiáng)的蛋白質(zhì)。能有效刺激病人外周血中CD4+ T 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)IFN-產(chǎn)生。在小鼠感染模型中,ESAT-6 特異性T 細(xì)胞主要是CD45RBlowC

12、D44highLFA-IhighL 2selectinlowCD4+ T 細(xì)胞(可能是一種長(zhǎng)效記憶性T 細(xì)胞,它較易分泌IFN-10。敲除ESAT6 基因能夠?qū)е陆Y(jié)核桿菌失去毒性,因此可從牛型結(jié)核桿菌中獲得活菌疫苗,并能應(yīng)用于鑒別小鼠是疫苗免疫還是結(jié)核感染11。因?yàn)樵囼?yàn)中接種敲除ESAT-6 基因的變異結(jié)核菌株和接種毒型結(jié)核菌株的小鼠都對(duì)PPD陽(yáng)性,而只有后者對(duì)ESAT-6 試驗(yàn)陽(yáng)性。研究表明肌注單獨(dú)由編碼ESAT-6 的DNA 疫苗難以取得理想效果4,因?yàn)镋SAT-6 不是很強(qiáng)的免疫原。Kamath 4等認(rèn)為編碼ESAT-6DNA 疫苗的保護(hù)作用比MPT64 強(qiáng),但這兩種DNA 疫苗的保護(hù)作

13、用并未超過(guò)BCG,所以需要加入其它免疫刺激源,如細(xì)胞因子,才能取得良好效果。Li等在構(gòu)建ESAT6 DNA疫苗時(shí),對(duì)能表達(dá)信號(hào)肽和不能表達(dá)信號(hào)肽的DNA疫苗進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,這兩種ESAT6 DNA疫苗的免疫保護(hù)力都很高,而且試驗(yàn)的重復(fù)性很好。2. 4 以MPT編碼基因重組的DNA 疫苗MPT-64 是結(jié)核菌生長(zhǎng)過(guò)程中的分泌性蛋白,也是重要的T 細(xì)胞抗原,能誘發(fā)結(jié)核菌感染的豚鼠發(fā)生很強(qiáng)的DTH 反應(yīng)。1999 年Kamath 等首次將結(jié)核分枝桿菌的MPT-64 蛋白編碼基因經(jīng)骨骼肌注射免疫C57BL/ 6 小鼠,第一次免疫后2 周即可產(chǎn)生特異性抗體,每間隔3 周免疫一次,共3 次,免疫過(guò)程

14、中血清中特異性抗體滴度逐漸增高。目前設(shè)想MPT-64 主要誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,體液免疫應(yīng)答不是其主要反應(yīng),這需進(jìn)一步研究其細(xì)胞免疫應(yīng)答加以證實(shí)。國(guó)內(nèi)有研究認(rèn)為,結(jié)核分枝桿菌MPT-64 DNA疫苗經(jīng)肌肉注射免疫小鼠只能誘導(dǎo)部分小鼠產(chǎn)生特異的體液免疫應(yīng)答,免疫效果存在明顯個(gè)體差異12。部分BCG 在減毒的過(guò)程中丟失了編碼MPT64 的基因,可用MPT64 代替PPD 作為皮試試劑,且其特異性較強(qiáng),因此可以鑒別小鼠是用BCG免疫過(guò)還是結(jié)核感染。MPT-63蛋白質(zhì)也有很強(qiáng)的刺激T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力。Li等將MPT-63基因克隆到pJW4303載體中構(gòu)建的DNA疫苗也顯示了較好的免疫保護(hù)效果;但是還

15、需要進(jìn)一步證明其免疫保護(hù)力的重復(fù)性。2. 5 其他編碼抗原基因構(gòu)建的DNA 疫苗目前對(duì)結(jié)核桿菌其他成分及其DNA 疫苗免疫效果的研究仍在深入進(jìn)行。DNA 疫苗編碼的蛋白還有 38kD 蛋白， hsp70 和 36 與 6kD 蛋白。PstS-1，PstS-2，PstS-3 蛋白免疫 小鼠可以刺激特異性抗體產(chǎn)生 （lgG） 并刺激生成 Th1 型細(xì)胞因子 IL 2 1 和 IFN-。 ， PstS-1 DNA 免疫不能激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，PstS-2 DNA 免疫僅可引起中等水平的應(yīng)答。而 PstSDNA 免疫可產(chǎn)生高水平的應(yīng)答13。目前一個(gè)主要障礙是還沒(méi)有準(zhǔn)確分離出結(jié)核菌的保護(hù) 性抗原， 但在小

16、鼠和豚鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)， 結(jié)核菌的分泌性抗原和表面抗原比胞質(zhì)抗原更易引起 保護(hù)性反應(yīng)，控制結(jié)核菌的復(fù)制13。因此將在這些抗原中進(jìn)行更深一步的研究，尋找新型 DNA 疫苗。 3 應(yīng)用前景的展望 結(jié)核 DNA 疫苗的研究歷史雖然很短，但是在小動(dòng)物的試驗(yàn)研究結(jié)果還是十分令人鼓舞的 4。目前的研究重點(diǎn)還是在篩選不同的結(jié)核桿菌基因，然后在初步篩選出來(lái)的候選者中， 進(jìn)一步在豚鼠實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證和精選。 由于豚鼠是結(jié)核桿菌的敏感動(dòng)物， 因而攻擊后臟器中 的活菌數(shù)可能在免疫組和對(duì)照組之間差異不大， 但是以組織的病理改變作為指標(biāo)， 則可以顯 示出 DNA 疫苗的免疫保護(hù)效果。在眾多結(jié)核 DNA 疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，很少

17、能夠在動(dòng)物試 驗(yàn)中具有 BCG 同樣的，甚至超過(guò) BCG 的免疫保護(hù)力。例如：Carl G. Feng 發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用編 碼 Ag85B 的 DNA 疫苗免疫，其減少菌落數(shù)效果不如 BCG 6。但如果接著接種 BCG，其 免疫效果就會(huì)顯著提高，脾中菌落數(shù)下降到 1/ 100，而單獨(dú)用 BCG 只能下降到 1/ 10 。 因?yàn)閷?duì) DNA 疫苗致敏的 TB 特異性 CD8+ T 細(xì)胞，BCG 能起到放大其功效作用，還能極 大提高 Th1 型 CD4 +T 細(xì)胞反應(yīng)，而后者是抵御 MTB 的關(guān)鍵。通過(guò)單獨(dú)免疫去篩選保護(hù) 力強(qiáng)的 DNA 疫苗，然后加入合適的促進(jìn)劑，將會(huì)使其免疫效果大大增強(qiáng)。組成聯(lián)合疫苗未

18、 來(lái)結(jié)核菌 DNA 疫苗的研究方向。DNA 疫苗不僅可以預(yù)防感染，還有治療作用。給嚴(yán)重感 染的小鼠接種 DNA 疫苗， 小鼠免疫系統(tǒng)就能從原來(lái)的抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)換到殺滅滯留結(jié)核桿菌的 狀態(tài)。不僅可以防止形成持續(xù)感染，還可以使已經(jīng)形成的持續(xù)感染得到清除2?？梢哉雇?將這種基因治療與傳統(tǒng)的化療結(jié)合起來(lái)可能會(huì)更好更快地治療人類的結(jié)核病。 DNA 疫苗可 引起細(xì)胞免疫和體液免疫，這不僅僅取決于抗原的性質(zhì)，還與 DNA 疫苗的接種途徑（如肌 肉注射或基因槍注射） ，接種量密切相關(guān)。基因免疫中引起細(xì)胞免疫應(yīng)答比引起體液免疫應(yīng) 答所需要的抗原量要少， 即以低劑量接種時(shí)較易引起細(xì)胞免疫應(yīng)答； 高劑量接種時(shí)則體液免

19、疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì)。因此可利用 DNA 疫苗接種的量來(lái)影響免疫應(yīng)答的類型。 為了增強(qiáng)結(jié)核 DNA 疫苗的免疫保護(hù)效果，目前有如下幾個(gè)研究方向：多價(jià)疫苗；免疫調(diào)節(jié) 因子；加速抗原的降解；鼻內(nèi)接種途徑。未來(lái)的 DNA 疫苗關(guān)鍵是要在誘導(dǎo) INF- 的分泌 和 CD8+ T 細(xì)胞產(chǎn)生，以引起有效的細(xì)胞免疫。利用編碼多肽的 DNA 疫苗將可能提高抵 抗各種疾病的疫苗的效果， 選擇合適的結(jié)核菌蛋白編碼基因和改造載體以增加 DNA 疫苗的 表達(dá)水平，制定完善的免疫策略和途徑、插入免疫調(diào)控序列和開(kāi)發(fā)新型佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答、 提高 DNA 疫苗的安全性等是今后研究的重點(diǎn)。 參考文獻(xiàn) 1. 廖國(guó)陽(yáng).基因免疫機(jī)理及安全性

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